Жк рф ст 31 ч 1: Постановление Пленума Верховного Суда Российской Федерации от 2 июля 2009 г. N 14 г. Москва от "О некоторых вопросах, возникших в судебной практике при применении Жилищного кодекса Российской Федерации"

Содержание

Частые вопросы юристу

Наталия Сивонина

юрист

Профиль автора

Каждому юристу иногда приходится отвечать на вопросы близких людей и знакомых.

Неважно, кем работает человек: помощником адвоката, преподавателем в вузе или специалистом по регистрации товарных знаков. Есть вопросы, которых не избежать ни одному обладателю диплома юриста. Я слышу эти вопросы регулярно — собрала самые популярные и ответила на них.

Как вернуть товар продавцу?

Возврат товара — это тот случай, когда даже небольшая деталь имеет значение. В двух словах на вопрос, как вернуть покупку в магазин, ответить нельзя — сначала нужно уточнить все подробности.

Еще есть перечень технически сложных товаров, в который входят, к примеру, механические наручные часы, ноутбуки, кофемашины и автомобили. Для них предусмотрен свой порядок возврата. Это значит, что если вы купили фен, у вас будет больше прав, чем при покупке кондиционера. Потому что кондиционер — технически сложный товар, а фен — нет.

Сообщество 02.03.21

Меня убедили, что нельзя сразу вернуть товар — сначала надо попробовать починить. Это законно?

Когда купили. Вернуть товар можно не когда захочется, а в определенный срок, который отсчитывается со следующего дня после покупки. Например, моя подруга купила холодильник по акции до того, как закончила ремонт. Спустя месяц она вскрыла коробку и обнаружила на корпусе холодильника досадную царапину. Возвращать его было поздно, поскольку царапина — несущественный недостаток, а холодильник — технически сложный товар. Если с момента покупки прошло больше 15 дней, вернуть его можно только из-за существенного недостатка.

Поэтому ответить на вопрос однозначно нельзя. Все зависит от товара, места покупки и причины возврата: покупка просто разонравилась или оказалась некачественной.

РЕАЛИТИ-ШОУ Т–Ж

Поставьте финансовую цель

И рассказывайте, как добиваетесь ее, став героем нашего онлайн-реалити

Подать заявку

Что будет, если прописать человека в квартире?

Одних беспокоит, стоит ли оформлять временную регистрацию другу и его ребенку, чтобы тот попал в нужную школу. Другие спрашивают, отсудит ли зарегистрированная невестка часть квартиры, если сын потом с ней разведется. Третьих волнуют прописанные дети: якобы потом их не выпишешь.

Вот главное, что нужно запомнить.

Человека с постоянной регистрацией придется выписывать через суд. Регистрация по месту жительства подтверждает, что человек может жить в квартире, пока не выпишется добровольно или собственник не выпишет его через суд.

Что делать? 12.03.20

Как выписать бывшего мужа из квартиры

Если зарегистрированный действительно живет в квартире, то придется просить суд не только снять его с регистрационного учета, но и выселить.

ст. 31 и ст. 35 ЖК РФ

Счет за коммунальные услуги может увеличиться, если вы платите по нормативу за каждого прописанного.

Проблемы с полицией и приставами.

Если прописанный человек что-то натворит, разыскивать его будут по адресу регистрации — придется объясняться с полицией. Штрафы ГИБДД будут приходить по месту прописки.

ст. 84 и ст. 80 закона «Об исполнительном производстве»

Еще домой могут прийти судебные приставы, если захотят изъять имущество по долгам прописанного человека. Они могут, например, забрать телевизор собственника, если тот не покажет чек, который подтвердит, что купил его он, а не должник.

Фиктивная регистрация. Если реально никто в квартиру вселяться не собирается, то есть регистрация заведомо фиктивная, — это преступление. Поэтому отказать в прописке не стыдно. Можно так и ответить: «Я слышал от знакомого юриста, что из-за фиктивной прописки могут быть проблемы с полицией и даже уголовное дело. Поэтому прописать не смогу».

Что делать? 15.05.20

Мама и бабушка хотят прописаться у меня в квартире ради пенсии

Как не заплатить налог при продаже квартиры?

Почему-то многие уверены, что налоговый кодекс знают назубок все юристы. Даже если юрист ненавидит налоговое право и специализируется на семейных спорах, рано или поздно ему придется отвечать на вопрос о налоге при продаже квартиры.

Напомню законные способы не платить налог или уменьшить его.

Продать квартиру позже минимального срока владения — трех или пяти лет в зависимости от ситуации. Тогда налога вообще не будет.

Уменьшить доходы на расходы при покупке квартиры. Тогда НДФЛ нужно будет заплатить только с разницы между суммой, за которую квартиру купили, и суммой, за которую продали.

подп. 2 п. 2 ст. 220 НК РФ

Не путайте с ситуацией, когда продаете одну квартиру и сразу покупаете более дорогую. Что именно вы купите на деньги от продажи имущества — другую квартиру, машину или турпутевку — налоговую не интересует. Важно только, за сколько вы купили то, что продаете, и сможете ли подтвердить это документами.

Этот способ не подходит для случаев, когда квартиру получили по безвозмездной сделке: например, в дар или в порядке приватизации.

Воспользоваться налоговым вычетом. Если нет документов, которые подтверждают расходы на приобретение квартиры, можно применить имущественный налоговый вычет в размере 1 000 000 Р. На эту сумму можно уменьшить доход, полученный при продаже жилых домов, квартир, комнат, дач, садовых домиков, земельных участков и долей в них.

подп. 1 п. 2 ст. 220 НК РФ

Зачесть налог к возврату в счет налога с продажи. Этот способ подходит, если вы не израсходовали свой имущественный налоговый вычет — до 260 000 Р к возврату. Так можно уменьшить или не платить НДФЛ при продаже жилья — зачесть налог к возврату в счет налога с продажи. Это сработает и когда у продавца нет права на вычет: например, если человек не работает или он ИП на упрощенке.

п. 4 ст. 78 и подп. 1 п. 3 ст. 220
НК РФ

Разобраться, нужно ли в вашей ситуации платить налог с продажи, можно с помощью специального калькулятора.

Как оформить передачу наличных?

Мы уже писали, как правильно давать деньги в долг. В случае с займом при получении и возврате денег нужно взять расписку. Но иногда наличными нужно оплатить покупку, например автомобиль. Или заплатить за наем квартиры. Если контрагент — обычный человек, не ИП и не самозанятый, то чек он выдать не может. В таком случае тоже обязательно просите расписку.

п. 2 ст. 808 и ст. 861 ГК РФ

В любой расписке должны быть ФИО и паспортные данные того, кто передает, и того, кто принимает. А также сумма цифрами и прописью, дата, подпись человека, который принимает деньги. Писать документ лучше собственноручно.

Частая ошибка в расписках — когда человек пишет, что получил деньги, но не пишет, за что. В такой ситуации очень сложно доказать, что вы, к примеру, оплатили купленный товар, а не вернули заем или перевели деньги в подарок. Поэтому попросите получателя денег указать в расписке, за что он их получил. А еще — привести ссылку на заключенный между вами договор. Например: «Получил 15 000 Р в качестве платы за проживание в квартире за октябрь 2021 года в соответствии с договором найма от 15 января 2021 года».

Одна моя родственница спросила, нужна ли расписка при перечислении денег на карту за разовые консультации. Расписка не нужна, так как это безналичный расчет и можно получить банковское подтверждение платежа. Но плательщики не всегда указывают назначение платежа. Поэтому лучше дополнительно зафиксировать факт получения платежа за конкретную услугу или товар. Например, указать в акте приема-передачи товара, что продавец получил за него все деньги, претензий к покупателю не имеет.

глава 2 положения Банка России от 24.12.2004 № 266-П

Может ли работодатель заставить уйти в отпуск по графику?

Так, один мой приятель решил разом взять 56 дней отпуска в июле-августе и уехать в Турцию. Работодатель ответил, что готов отпустить его только на две недели. Вот что я выяснила, когда разбиралась в этой ситуации.

Отпуск делится на части по соглашению между работником и работодателем. При этом одна часть отпуска не должна быть меньше 14 дней. Что касается остальных дней, то работодатель не может решить за сотрудника, какими частями он будет отгуливать остаток. Это пояснил и Роструд.

Но не стоит забывать про график отпусков. Это не просто бумажка, а локальный нормативный акт, который утверждает руководитель организации. График обязателен как для работодателя, так и для работника. Если в графике отпусков на лето запланировано 14 дней и сотрудника ознакомили с документом, работодатель может предоставить отпуск только на две недели.

Есть категории работников, которые вправе использовать отпуск в удобное для них время, даже несмотря на график отпусков. Например, это почетные доноры, совместители и некоторые многодетные родители.

Что будет, если просрочить ипотечный платеж?

Просрочка платежа — страшный сон любого заемщика. Многие представляют, как на следующий же день в дверь стучат судебные приставы, просят собрать вещи и отдать им ключи от квартиры.

Реальность не так страшна. По закону обратить взыскание на квартиру можно, только если заемщик систематически нарушал сроки внесения платежей. То есть больше трех раз в течение последних 12 месяцев. То, что просрочки незначительны, значения не имеет. В договоре ипотеки могут быть другие правила.

п. 5 ст. 54.1 закона об ипотеке

Если один раз не внести платеж вовремя, могут грозить только штрафные санкции. Причем они могут быть не какими захочется банку, а в пределах, установленных ЦБ РФ:

ключевой ставки Банка России на день заключения договора, если по его условиям проценты начисляются и за период просрочки;
0,06% от суммы просроченной задолженности за каждый день просрочки, если по условиям кредитного договора не начисляются проценты за пользование кредитом за период нарушения обязательств.

ч. 5 ст. 6.1 закона о потребительском кредите

Как отменить судебный приказ?

Судебный приказ — это постановление мирового судьи о взыскании денег по бесспорным делам на сумму не более 500 000 Р. По сути, это судебное решение, которое судья выносит без разбирательства.

ст. 121 и ст. 122 ГПК РФ

Особенность в том, что не нужно дополнительно получать исполнительный лист. Судебный приказ — это исполнительный документ, его можно сразу отнести к судебным приставам.

Иногда с судебным приказом могут столкнуться и те, у кого вообще нет долгов. Например, однажды моему коллеге пришло письмо с портала госуслуг. В нем говорилось, что в отношении коллеги возбудили исполнительное производство из-за задолженности по кредиту. Сумма долга была всего 6000 Р, но никаких долгов у коллеги не было. Поэтому платить он не собирался.

Как выяснилось, кто-то воспользовался паспортными данными или копией паспорта коллеги и оформил на него кредитную карту в малоизвестном банке. Адрес указали в другом городе: видимо, чтобы банк не нашел реального человека с этим паспортом. На основании этого кредитного договора суд вынес судебный приказ и отправил его по тому «левому» адресу. Разумеется, коллега его не получил. Долг продали коллекторам, и по их заявлению судебные приставы возбудили исполнительное производство. Так ничего не подозревающий человек стал должником.

Отменить судебный приказ несложно. Для этого нужно подать возражения судье, который его вынес. Возражения могут быть совершенно любыми — можно просто написать: «С требованиями не согласен, прошу отменить приказ». Главное — уложиться в срок.

Если приказ вынесен по заявлению госоргана, то возражения нужно отправить в течение 20 дней. В остальных случаях — в течение 10 дней со дня получения приказа. Сразу скажу: не забирать письма с почты — плохая идея. Если письмо вернется кредитору, суд будет считать, что должник его получил, и приказ вступит в силу.

Если пропустить срок, можно приложить к заявлению ходатайство о его восстановлении. Мой коллега так и поступил. К ходатайству он приложил копию паспорта, из которого следовало, что в момент вынесения приказа был прописан по другому адресу. А значит, не виноват, что не получил судебный приказ. Суд восстановил пропущенный срок и отменил приказ. Коллега направил постановление об отмене приказа приставам, и они прекратили исполнительное производство.

За какие коммунальные услуги можно не платить?

Также можно отказаться от навязанных управляющей компанией дополнительных услуг: например, видеонаблюдения или дополнительного озеленения. Но и то не всегда. Если решение о необходимости таких услуг принято на общем собрании собственников, отказаться от них нельзя, даже если на собрании вы не присутствовали или голосовали против.

ст. 44 и ст. 156 ЖК РФ

Одна из моих подруг каждый месяц оплачивала ЖКУ с большой комиссией. Однако компания, которая предоставляет услуги ЖКХ, должна обеспечить возможность оплачивать ее услуги без лишних сборов. Подруга нашла этот способ и теперь платит через личный кабинет на сайте поставщика услуг без комиссии.

ст. 16.1 и ст. 37 закона «О защите прав потребителей»

Также в некоторых случаях можно воспользоваться правом на перерасчет. Например, если не установлены счетчики на воду и электричество. Или собственник отсутствует по месту жительства более 5 дней и менее полугода из-за болезни, отпуска или временного отъезда. Однако для этого нужен акт обследования, который подтверждает, что в жилье технически невозможно установить счетчики.

п. 92 правил предоставления коммунальных услуг

Как обжаловать штраф за нарушение ПДД?

Первое, что я спрашиваю, когда мне задают вопрос, как обжаловать штраф: «Когда вы о нем узнали?» Дело в том, что на обжалование постановления есть всего 10 дней с момента получения документа.

Раньше обжаловать штраф можно было в ведомстве, которое назначило штраф, или в суде. Обратиться в суд через интернет по таким делам было нельзя: требовалось традиционное бумажное заявление, подписанное собственноручно. И решение можно было получить тоже только в бумажной форме.

Однако с 1 сентября 2021 года технологии наконец-то пришли на помощь водителям. Теперь штрафы за нарушения можно будет обжаловать через госуслуги и сайты судов. Потребуется электронная подпись: для обжалования подойдет простая подпись, которая есть у всех обладателей подтвержденного аккаунта на госуслугах. Я намеренно использую будущее время, так как на практике это пока не работает — на госуслугах такой опции пока нет.

Федеральный закон от 29.12.2020 № 471-ФЗ

С судами дело обстоит сложнее. Во-первых, пользоваться специальной формой на сайте суда можно будет, только если правонарушение зафиксировано видеокамерами. Если протокол оформил сотрудник ГАИ, никаких кнопок на сайте можно даже не искать. Во-вторых, у суда должна быть техническая возможность принять жалобу в электронном виде. Как показывает практика, такая возможность появится не сразу.

Как выбрать юриста?

Ко мне часто обращаются знакомые с просьбой порекомендовать конкретного юриста или хотя бы подсказать, по каким критериям его выбирать.

Мы уже писали о том, как выбрать адвоката и найти хорошего юриста. Конечно, идеальный вариант — заключить договор со специалистом по рекомендации или с крупной консалтинговой компанией, которая дорожит своей репутацией. Но первое не всегда удается, а второе может оказаться не по карману.

Вот несколько советов, которые я даю своим знакомым.

Не стесняйтесь попросить юриста показать диплом или удостоверение адвоката. У хорошего специалиста это вызовет только глубокое уважение к вам. Кроме того, по некоторым делам представителями могут быть только люди с высшим юридическим образованием. Дел, которые рассматривают мировые судьи и районные суды, это не касается.

ст. 49 ГПК РФ, ст. 49 УПК РФ

Если предстоит судебный спор, попросите ссылки на судебные дела, которые вел юрист. Если юрист специализируется на спорах с застройщиками, а вам предстоит развод, ищите специалиста по семейным делам. Если юрист накидал судебные решения, не скрыв персональные данные предыдущих клиентов, это плохой знак. Я бы не советовала иметь дело с таким специалистом.

Внимательно изучите договор. Особенно что входит в сумму, которую вы должны заплатить. Иногда юрист может утверждать, что это цена всего дела под ключ. Но договор предусматривает, что это только стоимость рассмотрения дела в первой инстанции.

Если заключаете договор с юридической фирмой, выясните, кто конкретно будет представлять ваши интересы, познакомьтесь с этим человеком и, если все устроит, попросите указать его ФИО в договоре. Иначе может получиться так, что вы беседовали с человеком, который блистал ораторским мастерством, а в суд придет начинающий юрист, который не может связать двух слов без бумажки.

Субсидии для малого бизнеса

Вы можете сформировать заявление на получение субсидии субъектом МСП, ведущим деятельность в пострадавших отраслях в связи с COVID-19

Сведения о налогоплательщике

ИНН:

Введите правильный ИНН

Ввести информацию о численности

ОКТМО:

Введите правильный ОКТМО

Численность:

Введите правильную численность

КПП:

Введите правильный КПП

Банковские реквизиты

Подписант заявления

Новые правила перевода жилого помещения в нежилое — Новости

9 июня 2019 года вступили в силу поправки в Жилищный кодекс, уточняющие условия и порядок перевода жилого помещения в нежилое в многоквартирном доме.

9 июня 2019 года вступил в силу Федеральный закон от 29 мая 2019 г. № 116-ФЗ “О внесении изменений в Жилищный кодекс Российской Федерации”. Данные изменения повлияли на порядок перевода жилого помещения в нежилое.

Что же изменилось?

1. В помещение должна быть исключена возможность доступа, после его перевода из жилого помещения в нежилое помещение, с использованием помещений, обеспечивающих доступ к жилым помещениям.

2. Кроме указанных в п. 2 ст. 23 ЖК РФ документов собственник помещения, для перевода жилого помещения в нежилое или нежилого помещения в жилое должен предоставить:

• протокол общего собрания собственников помещений в многоквартирном доме, содержащего решение об их согласии на перевод жилого помещения в нежилое помещение;
• согласие каждого собственника всех помещений, примыкающих к переводимому помещению, на перевод жилого помещения в нежилое помещение.

Здесь же, в п.2.2 ст. 23 ЖК РФ содержится определение примыкающего помещения. Это помещения, имеющие общую с переводимым помещением стену или расположенные непосредственно над или под переводимым помещением.

3. Теперь, если многоквартирный дом одноподъездный, то для принятия решения собственниками о переводе, необходимо собрать кворум из более чем две третьих голосов от общего числа голосов собственников, а если подъездов несколько, то более чем две третьих голосов от общего числа голосов собственников помещений в том подъезде дома, в котором находится переводимое помещение.

Полученный протокол общего собрания собственников и согласие на перевод помещения из нежилого в жилое включается в перечень документов, который представляется в орган местного самоуправления, для принятия решения о переводе помещения из жилого в нежилое в соответствии с нормами новой редакции статьи 23 ЖК РФ.

Необходимо сказать, что при отсутствии вышеуказанных документов, в том числе протоколов общего собрания собственников, использование жилого помещения в качестве нежилого, его переустройство будет являться незаконным.

ФИАН — Главная

	Постановление СК РФ
	Уважаемые коллеги! Напоминаем вам драматические события 30 октября 2019г., когда люди с автоматами и в масках заполнили Институт и полностью заблокировали работу администрации ФИАН. Проблемы возникли из-за деятельности фирмы «Триоптикс», которая на договорных отношениях арендовала несколько комнат у ФИАН. Небольшая компания занималась производством оптических элементов: зеркал, подложек, пластинок и линз. Указанные события происходили в рамках расследования уголовного дела №11902009601000064 по факту контрабанды иной военной техники, т.е. по признакам преступления, предусмотренного ч.3 ст.226.1 УК РФ. Указанное уголовное дело было возбуждено 17.10.2019 г. Прошло два года, Следственный комитет РФ провел огромную работу, проанализировав все обстоятельства дела. Наконец работа завершена, получено Постановление от 17.06.2021 г. о прекращении уголовного дела №11902009601000064 в связи с отсутствием события преступления. (Опубликовано 27.10.21)
	Коронавирус
	Уважаемые коллеги! В Москве вновь обострилась ситуация с заболеванием жителей города новой коронавирусной инфекцией. Ежедневно фиксируется свыше 6000 случаев заболеваний COVID-19 и свыше 70 смертей. Дирекция неоднократно обращалась с просьбой к сотрудникам пройти процедуру вакцинации. (Опубликовано 19.10.21)
	Школа молодых ученых «Быстропротекающие электровзрывные, электронные и электромагнитные процессы в импульсной электронике и оптоэлектронике» (БПИО-2021)
	Приглашаем молодых сотрудников, аспирантов и студентов принять участие в работе Школы молодых ученых «Быстропротекающие электровзрывные, электронные и электромагнитные процессы в импульсной электронике и оптоэлектронике» (БПИО-2021), которая пройдет в ФИАНе с 16 по 18 ноября 2021 года. Программа Школы включает в себя лекции ведущих ученых, устные доклады молодых ученых, а также стендовую сессию. Школа проводится при поддержке РНФ. Дополнительная информация представлена на сайте конференции: http://confelectronics.ru/ (Опубликовано 14.10.21)
	Разработка ФИАН – «гвоздь программы» Международной олимпиады по финансовой безопасности
	В начале октября 2021 года в Сочи состоялась первая Международная олимпиада по финансовой безопасности, организованная по поручению Президента Российской Федерации В.В. Путина.Главным мероприятием олимпиады стала презентация игровой платформы «Графус», разработанной ФИАН для обучения финансовой грамотности.Источник: Росфинмониторинг (Опубликовано 11.10.21)
	5-я ежегодная троицкая школа повышения квалификации преподавателей физики «Актуальные проблемы физики и астрономии: интеграция науки и образования»
	11 октября стартовала 5-я ежегодная троицкая школа повышения квалификации преподавателей физики «Актуальные проблемы физики и астрономии: интеграция науки и образования» (ТШПФ-2021), организованная в формате всероссийской научно-практической школы-конференции. ТШПФ-2021 будет проходить в Троицке с 11 по 15 октября. (Опубликовано 11.10.21)

N-гидроксибензимидазол. Ингибиторы фактора транскрипции LcrF в Yersinia: новые антивирулентные агенты

Abstract

LcrF, фактор транскрипции множественного адаптационного ответа (MAR), регулирует вирулентность в Yersinia pestis и . В поисках низкомолекулярных ингибиторов LcrF был синтезирован акриловый амидный ряд из N -гидроксибензимидазолов и исследована SAR (взаимосвязь структура-активность).Выбранные тестируемые соединения продемонстрировали ингибирующую активность в первичном бесклеточном анализе связывания LcrF-ДНК, а также во вторичном анализе целых клеток (анализ цитотоксичности Y. pseudotuberculosis , зависимый от системы секреции типа III). Ингибиторы in vitro не проявляли измеримой антибактериальной активности , что подтверждает, что они не нацелены на рост бактерий. Эти результаты демонстрируют, что ингибиторы N -гидроксибензимидазола, представленные 14 , 22 и 36 , являются эффективными противовирулентными агентами и обладают потенциалом предотвращения инфекций, вызываемых Yersinia spp.

Введение

Yersinia pestis ( Y. pestis ), грамотрицательный патоген, возбудитель чумы, ¹, вызывает серьезную озабоченность в связи с его потенциальным использованием в качестве биологического оружия. ² Сообщалось о клинических изолятах с одно- и множественной лекарственной устойчивостью (MDR) Y. pestis , ³, что подрывает эффективность существующих терапевтических средств. Таким образом, с учетом постоянно растущих проблем устойчивости к противомикробным препаратам во всем мире, ⁴ предпринимают усилия по поиску новых методов лечения MDR Y.pestis рассматриваются как насущная потребность общественного здравоохранения.

Большинство антибиотиков, появившихся на рынке или находящихся на поздней стадии клинической разработки в последние годы, являются улучшенными производными существующих химических классов, за очень немногими исключениями. ⁵ ^, ⁶ Такие антибиотики, безусловно, принесут пользу пациентам, инфицированным лекарственно-устойчивыми бактериями. Однако с увеличением использования новых лекарств появление устойчивых штаммов, вероятно, будет вопросом времени.Попытки идентифицировать новые химические классы антибиотиков с новыми механизмами действия посредством высокопроизводительного скрининга на основе мишеней оказались не очень плодотворными. ⁶ Очевидно, что преодоление устойчивости к бактериям оказалось сложной задачей и потребует более инновационных исследовательских подходов.

В качестве альтернативы традиционной антимикробной химиотерапии в недавней литературе сообщалось о стратегиях нацеливания на вирулентность патогенов. ⁷ ^— ⁹ В связи с этим мы разрабатываем низкомолекулярные противоинфекционные препараты, которые нацелены на способность бактерий вызывать инфекцию (вирулентность), а не на рост.¹⁰ Такие антивирулентные агенты можно использовать для предотвращения заражения людей в среде с высоким риском, например, в случае биотерроризма. Интересующие бактериальные мишени вирулентности — это факторы транскрипции множественного адаптационного ответа (MAR) ¹¹ ^, ¹², которые являются регуляторами экспрессии вирулентности. ¹³

Белки MAR характеризуются двумя высококонсервативными ДНК-связывающими доменами спираль-поворот-спираль (HTH). ¹⁴ Они присутствуют во многих клинически важных грамотрицательных и грамположительных бактериях.¹⁵ Они контролируют способность бактерий вызывать инфекции, сопротивляться антибиотикам и адаптироваться к агрессивным средам. Инактивация белков MAR мутацией снижает вирулентность бактерий в моделях инфекции на животных, но не влияет на рост бактерий in vitro . ¹³ ^, ¹⁶ ^— ¹⁸ Таким образом, ингибиторы белков MAR не обладают присущей им антимикробной активностью и с гораздо меньшей вероятностью, чем антибиотики, оказывают избирательное давление для развития устойчивости.Белки MAR не были описаны в эукариотических клетках, что делает это семейство белков желательной мишенью при открытии противомикробных препаратов.

LcrF представляет собой фактор транскрипции MAR, связанный с вирулентностью у Y. pestis и Y. pseudotuberculosis . Он регулирует экспрессию системы секреции типа III (T3SS), основной детерминанты вирулентности многих грамотрицательных бактерий (). При контакте с клеткой-хозяином или после изменения температуры (например, от 26 ° C у блох до 37 ° C у человека-хозяина) LcrF экспрессируется, а затем активирует экспрессию внешних белков Yersinia (Yops) и T3SS.¹⁹ Yops (т.е. цитотоксины) секретируются в клетки-хозяева через T3SS и приводят к клеточному апоптозу. ²⁰ ^, ²¹ Мутанты, не экспрессирующие T3SS, демонстрируют резкое ослабление вирулентности в моделях инфекции на целых клетках и на животных. ²² ^— ²⁴ Flashner и др. . недавно исследовали эффекты делеции lcrF (Δ lcrF ) на патогенность Y. pestis на мышиной модели септической инфекции.¹⁶ LD ₅₀ (50% летальная доза) дикого типа Y. pestis в этой модели составляет приблизительно 1 колониеобразующую единицу (КОЕ), тогда как LD ₅₀ для Δ lcrF Y. pestis > 100 КОЕ. Этот результат демонстрирует, что LcrF является действительной мишенью против вирулентности у Yersinia spp. ²⁵

Схематическое изображение экспрессии Yop и экспрессии T3SS (система секреции типа III) в Yersinia spp.

В литературе описаны низкомолекулярные соединения, которые ингибируют вирулентность Yersinia .²⁶ ^— ²⁸ Эти соединения, как известно, ингибируют секрецию типа III Yersinia ; однако их конкретные бактериальные мишени не определены. Напротив, мы стремимся подавить вирулентность Yersinia на уровне транскрипции, воздействуя на белок LcrF, который, в свою очередь, регулирует экспрессию T3SS. На сегодняшний день в литературе не сообщалось о низкомолекулярных ингибиторах, которые непосредственно нацелены на LcrF. ²⁹

Ранее мы сообщали о N -гидроксибензимидазольных соединениях ( 1 ) (), которые продемонстрировали ингибирующую активность в отношении белков MAR MarA, SoxS и Rob в E.coli . ¹⁰ Каркас N -гидроксибензимидазола был первоначально идентифицирован в экспериментах по стыковке малых молекул с использованием сокристаллических структур MarA-ДНК и Rob-ДНК. ³⁰ ^, ³¹ Хотя рентгеновская кристаллическая структура комплекса LcrF-ДНК или белка LcrF до настоящего времени не была определена, аминокислотная последовательность LcrF в ДНК-связывающем домене, как известно, гомологична таковой из MarA, SoxS и Rob с идентичностью 31% и сходством 53% на участке длиной 92 аминокислоты.³² Таким образом, первоначальный скрининг ранее идентифицированных ингибиторов рассматривался как разумная отправная точка в поисках ингибиторов LcrF. Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать и разработать ингибиторы связывания LcrF-ДНК с использованием in vitro внеклеточных и цельноклеточных анализов, а также in vivo мышиных моделей инфекции, вызванной Yersinia spp.

Общая структура N -гидроксибензимидазолов

Химия

N -гидроксибензимидазолов в свинцовом ряду были синтезированы с использованием модифицированных литературных методик ().³³ ^, ³⁴ Замещенный o -нитрофторбензол или соответствующий хлораналог подвергали реакции нуклеофильного ароматического замещения (S _N Ar) с 4-аминобензиламином с образованием 4-аминобензил-2- нитрофениламин ( 3 ). Последующая реакция циклизации в присутствии основания, такого как гидрид натрия, трет--бутоксид калия или метоксид натрия, привела к образованию 2- (4-аминофенил) -1-гидроксибензимидазола ( 4 ).Когда L представляет собой F или Cl, использовали ненуклеофильное основание, такое как гидрид натрия, чтобы избежать реакции S _N Ar в этом положении (см.). Дальнейшая реакция циклизованного промежуточного продукта 4 с подходящим хлорангидридом (примерно 2,5 эквивалента) либо в пиридине, либо в N -метилпирролидоне дает бис-ацилированный продукт 5 (не выделен), который затем гидролизуют в на месте , чтобы получить товар 6 . Альтернативно, в зависимости от коммерческой доступности или совместимости функциональных групп, N -гидроксибензимидазолов также получали, исходя из замещенного 4-аминобензонитрила ().Образование амида с хлорангидридом с последующим каталитическим гидрированием дало производное 4-фенилакриламидобензиламина 7 , которое затем реагировало с активированным нитробензолом, давая 8 . Впоследствии с промежуточным соединением 8 (для L = F или Cl) были введены различные функциональные группы R ₅. Для замещений аминогрупп в R ₅ соединение 8 реагировало с соответствующими аминами в присутствии бикарбоната натрия, и затем, после реакции циклизации, получалось 9 .Для алкоксигрупп при R ₅ реакция нуклеофильного замещения и циклизация 8 происходила в одном сосуде в присутствии соответствующих спиртов (например, метанола, этанола и т. Д.) И основания, такого как гидрид натрия. Этот путь синтеза оказался высокоэффективным при образовании R ₅ замещенных N производных -гидроксибензимидазола 9 .

Метод A: Общий синтез N -гидроксибензимидазолов

Метод B: Альтернативный синтез N -гидроксибензимидазолов

Результаты и обсуждение

Ингибирующая активность N -гидроксибензимидазолов была измерена в витро-гидроксибензимидазоле. бесклеточный анализ связывания LcrF-ДНК и представлен как значения IC ₅₀ (см. Экспериментальный раздел).

Среди ранее идентифицированных ингибиторов связывания SoxS-ДНК соединение 10 () показало хорошую ингибирующую активность в отношении LcrF (IC ₅₀ = 17,7 мкМ). Как показано в нашем предыдущем сообщении, ведущая серия ингибиторов в анализе связывания SoxS-ДНК состояла из ядра N -гидроксибензимидазола с замещенным фениламидом. ¹⁰ Для ингибирования связывания LcrF-ДНК были исследованы четыре различные части основной структуры для установления SAR: линкер, концевая фенильная группа (R ₃ / R ₄), средняя фенильная группа (X, Y, R _X и R _Y), и бензимидазольное кольцо (R ₅, R ₆ и W) (общая структура 2 дюймов).

Таблица 1

Линкер SAR N -гидроксибензимидазолов

9011 9011 9011 9011 9018 9018 17,7 15311 3,93 9011 NHCOCH = CH

Соединение	Линкер	LcrF IC ₅₀ (мкМ) ^a
11	CH ₂ NHCO	> 58,4
12	NHCOCH ₂	> 58.4
13	NHCOCH ₂ CH ₂	> 53,5
14	NHCOCH = CH
14,0

Для дальнейшего повышения активности 10 между двумя фенильными группами было введено множество различных линкеров (). Согласно нашей предыдущей работе, амидный линкер в 10 обеспечивает лучшую ингибирующую активность, чем другие линкеры, такие как амино- и эфирные группы.¹⁰ Таким образом, в этом исследовании линкерного SAR мы сосредоточились на оценке выбранных аналогов амида ( 11 — 15 ). Удлинение амидного линкера в 10 метиленовыми группами в любом направлении ( 11 , 12 и 13 ) приводило к производным, активность которых не поддается измерению. Введение винильной группы в соединение 14 улучшило ингибирование (IC ₅₀ = 3,9 мкМ), однако добавление другой метиленовой группы в 15 (IC ₅₀ = 14.0 мкМ) снижение активности. В этом ряду линкеров акриловая амидная группа в 14 была установлена как наиболее эффективный линкерный фрагмент, что побудило к дальнейшим исследованиям более замещенных производных в ряду акриловых амидов (-).

Таблица 2

Эффект замещения R ₃ и R ₄

> 44,8

Соединение	R ₃ / R ₄	LcrF33 IC ₅₀ ₅₀ (мкМ)
14	4-Ф.	3.9
16	H	6,9
17	2,4-F / F	5,0
18		3,414-F /	14,5
19	4-канальный	16,4
20	4-канальный ₃	0,8

21903	20.9
22	4-OCH ₃	8,0
23	4-CF ₃	6,4
	OCH ₃ / OCH ₃	38,5
25	4- iso -пропил	> 50,9
26		₂	16.9
27	4-1 H — [1,2,4] триазол	35,7
28	4-1 H -имидазол
29	4-OH	> 57,0

Таблица 5

Эффект замещения R ⁶

Соединение	W 6297	R ₅₀ (мкМ)
14	C	НЕТ ₂	3.9 ^a
42	C	H	> 100 ^b
43	N	—	> 54.81433 9030	C	F	> 100 ^b
45	C	CN	8,3 ^a
46		C	C ^b
47	C	CF ₃	59.7 ^b
48	C	COCh4	39,4 ^b
49	C	SO ₂ CH4 ₃
50	C	1 H -пиразол	53,7 ^a
51	C	1 H14-имидазол 373 ^a
52	C	COOH	38,5 ^b

In были оценены еще четырнадцать соединений с различными замещениями R ₃ / R _{4. Среди исследованных соединений 4-H ( 16 ), 2,4-F / F ( 17 ), 4-CH ₃ ( 20 ), 4-OCH ₃ ( 22 ) и 4-CF ₃ ( 23 ) показали немного улучшенную или сопоставимую ингибирующую активность с таковой 14 , тогда как относительно большие замены в 24, 25, 27 и 28 привели к потере активности.В результате модификации R ₃ / R ₄ не было получено четкого SAR, однако данные свидетельствуют о том, что небольшая липофильная группа на R ₃ / R ₄ является общим требованием для хорошего ингибитора. Дальнейший анализ SAR в этой серии был бы затруднен без наличия структурной информации о сайте связывания белка LcrF. Соединение 20 показало лучшую ингибирующую активность (IC ₅₀ = 0,8 мкМ) в этой серии.}

В следующем наборе производных N -гидроксибензимидазола выбранные модификации были внесены в среднее фенильное кольцо ().Замена атомов азота в положениях X ( 30 ) и Y ( 31 ) показала сравнимую с небольшим снижением активности по сравнению с их соответствующим углеродным аналогом 14 . В то время как замещение атома фтора в R _Y ( 33 ) допустимо, фтор в R _X ( 32 ) неблагоприятен для активности. Обе группы -CH ₃ по R _X ( 34 ) и группа -OCH ₃ по R _Y ( 35 ) показали пониженную активность по сравнению с 14 .Как указывает SAR в, среднее фенильное кольцо вряд ли вмещает расширенный диапазон замещений.

Таблица 3

Эффект замещения на среднем фенильном кольце

9029 902930 9029 9029 14 33

Соединение	X	Rx	Y	Ry	LcrF IC ₅₀ (мкМ) ³
C	H	C	H	3,9
30	N	—	C	H	7.4
31	C	H	N	—	10,8
32	C	F				C	H	C	F	6.5
34	C	CH ₃	C	H	25.3
35	C	H	C	OCH ₃	13,5

суммирует эффект замещения групп R ₅. В то время как группа -CH ₃ в 36 сохранила активность 14 , группа -OCH ₂ CH ₃ в 37 привела к четырехкратному снижению по сравнению с 14 . Это может быть связано с повышенным стерическим эффектом группы -OCH ₂ CH ₃ в 37 .Замена -F в R ₅ ( 38 ) показала значительно сниженную активность. Учитывая относительно небольшой размер фтора, его эффект акцептирования электронов мог способствовать слабой активности 38 . Помимо потенциально неблагоприятного стерического эффекта группы -N (CH ₃) ₂, факторы, способствующие бездействию 39 , не изучены. Ингибирующая активность соединения 40 объясняется его неспецифическим связыванием с ДНК, как определено с помощью анализа электрофореза в агарозном геле (см. Экспериментальный раздел), а не ингибированием связывания LcrF-ДНК.Учитывая аналогичную основную природу аминогруппы в R ₅, соединение 41 , вероятно, также будет связываться с ДНК.

Таблица 4

Эффект замещения R ₅

Соединение	R ₅	LcrF IC ₅₀ (мкМ)

36	CH ₃	7.6 ^a
37	OCH ₂ CH ₃	17,1 ^a
38	F	26,63 33	F	26,63 33 9030 34	N (канал ₃) ₂	66,0 ^b
40	N (канал ₃) канал ₂ канал ₂ N (канал ₃) 2	3.3 ^c
41	OCH ₂ CH ₂ (1 -метил-4-пиперазин)	3,1 ^c

Влияние различных групп R4 _{6 _{резюмируются в. Из двенадцати оцениваемых групп с R ₆ группа -NO ₂ в 14 и группа -CN в 45 проявляли большую ингибирующую активность, чем другие. В литературе группы -COCH ₃ и -SO ₂ CH ₃ описаны как изостерические замены для группы -NO ₂, ³⁵, тогда как группа имидазола указана как биоизостер -NO ₂ и группы -CN.³⁶ Однако в нашем ряду N -гидроксибензимидазола ни один из этих потенциальных изостер (в 48, 49 и 51 ) не поддерживал активность 14 . Из других групп R ₆ группа -COOH в 52 может иметь свойства, аналогичные свойствам (например, липофильность, молярный объем и ионизируемость), что и группа -NO ₂ в 14 . Тем не менее, соединение 52 не обладает ингибирующей активностью, предположительно из-за донорной способности группы -COOH к связыванию водорода.}}

Отобранные соединения в серии акриловых амидов (IC ₅₀ ≤ 25 мкМ) подвергали скринингу с использованием анализа цитотоксичности целых клеток (ингибирование T3SS-зависимого Y. pseudotuberculosis , убивающего макрофаги in vitro ). ³⁷ ^, ³⁸ В качестве контрольного эксперимента все соединения были протестированы на их внутреннюю токсичность и были нецитотоксичными in vitro для неинфицированных мышиных макрофагов J774A.1 в концентрации 50 мкг / мл. В этом анализе нуль-мутантный штамм lcrF (Δ lcrF ) обычно индуцирует только 15-25% цитотоксичности, вызываемой штаммом Y дикого типа.псевдотуберкулез (WT) (). Среди 20 тестируемых соединений 14, 18, 19, 22, 36 и 37 снижали цитотоксичность Y. pseudotuberculosis до уровня, приближающегося к уровню мутанта Δ lcrF (). Активность (значения IC ₅₀) в бесклеточном анализе связывания LcrF-ДНК не всегда коррелировала с активностью в анализе целых клеток. Например, соединение 19 и 31 , которое продемонстрировало аналогичную ингибирующую активность в анализе связывания LcrF-ДНК (IC ₅₀ = 16.4 и 10,8 мкМ соответственно) имели очень разные активности в анализе целых клеток. В то время как соединение 19 сильно ингибировало цитотоксичность, соединение 31 было лишено какой-либо измеримой активности в анализе целых клеток. Кроме того, соединение 20 , лучший ингибитор (IC ₅₀ = 0,8 мкМ), идентифицированный в анализе связывания LcrF-ДНК, было относительно неактивным в анализе на целых клетках. Это отсутствие активности целых клеток могло быть результатом плохой проницаемости мембраны; однако переменные (например,g., физико-химические параметры), влияющие на проницаемость соединений, не совсем понятны. Также могли быть необнаруженные различия в растворимости соединений в средах для анализа целых клеток, которые отличаются от сред, используемых в анализе связывания LcrF-ДНК (см. Экспериментальный раздел). Также возможно, что N -гидроксибензимидазолы могут оказывать свое действие на мишени, отличные от LcrF, в анализе целых клеток. В целом результаты демонстрируют, что выбранные соединения с хорошей ингибирующей активностью в отношении связывания LcrF-ДНК также эффективно ингибируют вирулентность Yersinia в анализе целых клеток.

Ингибирование цитотоксичности, вызванной Y. pseudotuberculosis в клетках J774A.1. WT, штамм дикого типа (YPIIIpIB1) Y. pseudotuberculosis ; Δ lcrF , нуль-мутантный штамм lcrF (YPIIIpIB1Δ lcrF ) Y. pseudotuberculosis . Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение при n ≥ 4 (количество повторов).

Для подтверждения целевой специфичности выбранные соединения ( 14 , 22 и 36 с IC ₅₀ ≤ 10 мкМ) были дополнительно оценены в анализах связывания как ExsA-ДНК, так и SlyA-ДНК ().ExsA представляет собой фактор транскрипции MAR, обнаруженный в Pseudomonas aeruginosa , и имеет высокую степень гомологии с LcrF в ДНК-связывающем домене (85% идентичности и 92% сходства). ³² Следовательно, если эти ингибиторы действительно нацелены на ДНК-связывающий домен белка LcrF, они, вероятно, будут ингибировать связывание ExsA-ДНК с аналогичной эффективностью. Как показано на фиг.3, все три тестируемых соединения показали очень близкие значения IC ₅₀ как для LcrF, так и для ExsA. ДНК-связывающий мотив SlyA, транскрипционного фактора семейства MarR в Salmonella spp., отличается от белков MAR. ³⁹ ^, ⁴⁰ Таким образом, для проверки специфичности ингибиторов LcrF использовали анализ связывания SlyA-ДНК. В анализе связывания SlyA-ДНК не наблюдали поддающейся измерению активности ингибиторов LcrF (). Большинство производных N -гидроксибензимидазола, протестированных в анализах электрофореза в ДНК-связывающем агарозном геле, не обнаруживали детектируемого связывания с ДНК, за исключением соединений, структурно связанных с 40 и 41 .Эти результаты подтверждают целевую специфичность ингибиторов N -гидроксибензимидазола в отношении факторов транскрипции MAR. В испытании на чувствительность к противомикробным препаратам in vitro соединения 14, 22 и 36 не показали поддающейся измерению антибактериальной активности против Y. pseudotuberculosis , а также S. aureus и E. coli (), подтверждая, что они не нацелены на рост бактерий.

Таблица 6

Целевая специфичность и in vitro антибактериальная активность

Соединение	IC ₅₀ (мкМ) ^a			МИК (мкг / мл)

	9307 LcrF						ExsA ^b	SlyA ^c	Y.псевдотуберкулез ^d	S. aureus ^e	E. coli ^f
14	3,9	3,5	> 53,8 64314		> 53,8 64314	> 64
22	8,0	5,9	> 55,2	> 64	> 64	> 64
36	7.6	6,7	> 52	> 64	> 64	> 64

Выводы

Был разработан новый класс малых молекул на основе N -гидроксибензимидазоловых ингибиторов F в качестве каркаса L-гидроксибензимидазола. Связывание с ДНК. Они подавляют вирулентность Yersinia , воздействуя на белок LcrF, фактор транскрипции MAR. Некоторые соединения из серии акриловых амидов продемонстрировали ингибирующую активность в бесклеточном анализе связывания LcrF-ДНК.Их противовирулентная активность была дополнительно подтверждена с помощью T3SS-зависимого анализа целых клеток. Этот класс соединений, представленный 14, 22 и 36 , не является антибактериальным, нецитотоксичным, не связывается с ДНК и проявляет специфичность в отношении белков MAR. Эта работа предполагает, что новый подход к нацеливанию на вирулентность патогенов может быть реализован на уровне транскрипции у Yersinia spp. N -гидроксибензимидазолы, описанные в этой работе, являются эффективными противовирулентными агентами in vitro и потенциально могут быть превращены в лекарственные препараты-кандидаты против болезней, вызываемых Yersinia spp.

Экспериментальная часть

Общие положения

Все химические реакции проводились в атмосфере аргона или азота, если не указано иное. Все реагенты и растворители были приобретены у коммерческих поставщиков и использовались без дополнительной очистки. За реакциями следили с помощью аналитической ВЭЖХ и / или ЖХМС. Следы аналитической ВЭЖХ записывали с использованием колонки Luna C ₁₈-фенилгексил (50 мм × 4,6 мм, 5 микрон) с любой из кислот (0.1% об. / Об. CF ₃ COOH в воде в качестве растворителя A, 0,1% об. / Об. CF ₃ COOH в ацетонитриле в качестве растворителя B) или основной (20 мМ триэтаноламин в воде в качестве растворителя A и ацетонитрил в качестве растворителя B) среды с λ _det установлен на 280 нм. Спектры ЖХМС (Shimadzu LCMS-2010 EV) записывали с использованием 0,2% об. / Об. HCOOH в воде в качестве растворителя A и 0,2% об. / Об. HCOOH в ацетонитриле в качестве растворителя B (λ _det = 280 нм) с Luna C _{18 Колонка} Synergi (50 мм × 4,66 мм, 5 микрон) для ЖХ с ESI-MS, работающим в положительном режиме, если не указано иное.Спектры ЯМР ¹ H регистрировали в ДМСО- d ₆ с использованием спектрометра ЯМР Bruker DPX300, работающего на частоте 300 МГц. Химические сдвиги ЯМР ¹ H приведены в м.д. (δ) относительно пика остаточного протонированного растворителя. Чистоту конечных соединений оценивали на основании аналитической ВЭЖХ, и результаты были выше 95%, если не указано иное.

Метод A. Общий синтез производных 4-аминобензил- (2,4-динитрофенил) амина (3)

К раствору производных 4-аминобензиламина (25.5 мл, 225 ммоль) и порошкообразного NaHCO ₃ (94,5 г, 1125 ммоль) в безводном ДМФ (300 мл) по каплям добавляли 2,4-динитрофторбензол (18,8 мл, 150 ммоль) при комнатной температуре. Через 2 часа раствор медленно разбавляли водой (1000 мл) для осаждения продукта, который собирали на воронке с фриттой, промывая водой до тех пор, пока элюент не стал бесцветным. Твердое вещество дополнительно сушили в высоком вакууме с получением продукта 3 в виде ярко-оранжевого твердого вещества (43 г, выход 99%). Этот неочищенный материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 9,18 (т, J = 5,7 Гц, 1H), 8,86 (д, J = 3,0 Гц, 1H), 8,22 (дд, J = 2,7, 9,6 Гц, 1H), 7,13 (д, J = 9,6 Гц, 1H), 7,05 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 6,53 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 5,05 (с, 2H) , 4,54 (д, J = 6,0 Гц, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₁₃ H ₁₂ N ₄ O ₄], 288,26; найдено 330,10 [M + H + CH ₃ CN] ⁺.

Общий синтез производных 6-нитро-2- (4-аминофенил) -1-гидроксибензимидазола (4)

К раствору N производного — (4-аминобензил) -2,4-динитроанилина 3 ( 21.6 г, 74,9 ммоль) в безводном ДМФ (75 мл) медленно добавляли NaOMe (30% мас. / Мас. В МеОН) (67,5 г, 375 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере аргона. После добавления раствор нагревали до 60 ° C в течение 2 часов. После охлаждения до температуры окружающей среды раствор переносили в колбу Эрленмейера или высокий химический стакан, разбавляли водой (700 мл) и затем подкисляли насыщенной лимонной кислотой. Образовавшийся осадок собирали на спеченной воронке, промывая водой. Неочищенный продукт очищали перекристаллизацией из горячего EtOH с получением 4 в виде коричневого твердого вещества (18.1 г, выход 90%). ¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,36 (с, 1H), 8,22 (д, J = 2,4 Гц, 1H), 8,08-8,04 (м, 3H), 7,67 ( д, J = 8,7 Гц, 1H), 6,68 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 5,91 (шир. с, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₁₃ H ₁₀ N ₄ O ₃], 270,25; найдено 271,05 [M + H] ⁺.

Общий синтез

N -ацил-6-нитро-2- (4-аминофенил) -1-гидроксибензимидазольных производных (6)

К раствору 6-нитро-2- (4-аминофенил) -1- производное гидроксибензимидазола 4 (1.0 ммоль) в безводном пиридине (2,0 мл) добавляли хлорангидрид (2,5 ммоль) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 2–3 ч раствор разбавляли 3 н. NaOH (6,0 мл) и перемешивали еще час. Раствор темно-янтарного цвета переносили в колбу Эрленмейера или химический стакан путем разбавления водой (100 мл), а затем подкисляли насыщенной лимонной кислотой. Образовавшийся осадок собирали на спеченной воронке, промывая водой. Неочищенный продукт 6 дополнительно очищали либо препаративной ВЭЖХ, либо перекристаллизацией в горячем EtOH.

4-фтор-

N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) бензил] бензамид (11)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,64 (с, 1H), 9,19 (т, J = 5,7 Гц, 1H), 8,39 (д, J = 2,1 Гц, 1H), 8,29 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 8,14 (дд, J = 2,4, 9 Гц, 1H), 8,01 (дд, J = 5,7, 8,7 Гц, 2H), 7,85 (д, J = 9 Гц, 1H), 7,55 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 7,34 (т, J = 9 Гц, 2H), 4,59 (д, J = 6 Гц, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₁ H ₁₅ F ₁ N ₄ O ₄], 406.38; найдено 407,18 [M + H] ⁺.

2- (4-фторфенил) —

N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] ацетамид (12)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,56 (с, 1H), 10,41 (с, 1H), 8,23 (д, J = 2,3 Гц, 1H), 8,20 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 8,01 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H), 7,71 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,70 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,28 (дд, J = 5,7, 8,6 Гц, 2H), 7,06 (т, J = 8,9 Гц, 2H), 3,60 (с, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₁ H ₁₅ F ₁ N ₄ O ₄], 406.38; найдено 407,17 [M + H] ⁺.

3- (4-фторфенил) —

N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] пропионамид (13)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,63 (с, 1H), 10,39 (с, 1H), 8,34 (д, J = 2,2 Гц, 1H), 8,30 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 8,12 (дд, J = 2,2, 8,9 Гц, 1H), 7,81 (д, J = 8,9 Гц, 2H и с, 1H), 7,31 (дд, J = 8,5, 5,8 Гц, 2H ), 7,12 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 2,94 (т, J = 7,4 Гц, 2H), 2,69 (т, J = 7.8 Гц, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₇ F ₁ N ₄ O ₄], 420,40; найдено 421,09 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] акриламид (14)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,61 (с, 1H), 10,54 (с, 1H), 8,37 (д, J = 2,0 Гц, 1H) , 8,35 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,14 (дд, J = 2.2, 8,9 Гц, 1H), 7,94 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,83 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,73 (дд, J = 5,7, 8,6 Гц, 2H), 7,66 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,83 (д, J = 15,7 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₅ F ₁ N ₄ O ₄], 418,39; найдено 419,08 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) бензил] акриламид (15)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.65 (с, 1H), 8,75 (т, J = 5,9 Гц, 1H), 8,39 (д, J = 2,4 Гц, 1H), 8,30 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 8,14 (дд, J = 2,4 , 9 Гц, 1H), 7,86 (д, J = 9 Гц, 1H), 7,66 (дд, J = 5,7, 8,4 Гц, 2H), 7,53 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 7,51 (д, J = 16,2 Гц, 1H), 7,27 (т, J = 9 Гц, 2H), 6,68 (д, J = 15,9 Гц, 1H), 4,52 (д, J = 6 Гц, 2H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₇ F ₁ N ₄ O ₄], 432,41; найдено 433,23 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3-фенилакриламид (16)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.65 (с, 1H), 10,51 (с, 1H), 8,32 (д, J = 2,2 Гц, 1H), 8,30 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 8,09 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H ), 7,90 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,78 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,62 (д, J = 8,5 Гц, 2H), 7,61 (д, J = 15,2 Гц, 1H), 7,47–7,37 (м, 3H), 6,85 (д, J = 15,8 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₆ N ₄ O ₄], 400,40; найдено 401,11 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (2,4-Дифторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -акриламид (17)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.62 (brs, 1H), 10,62 (с, 1H), 8,34 (д, J = 2,2 Гц, 1H), 8,33 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,11 (дд, J = 2,4, 9 Гц, 1H ), 7,93 (д, J = 9 Гц, 2H), 7,81 (д, J = 9 Гц, 1H), 7,78 (т, J = 8,7 Гц, 1H), 7,63 (д, J = 15,9 Гц, 1H), 7,39 (дт, J = 2,7, 9,6 Гц, 1H), 7,21 (дт, J = 2,1, 8,4 Гц, 1H), 6,94 (д, J = 15,9 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₄ F ₂ N ₄ O ₄], 436,38; найдено 437,08 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (3,4-Дифторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -акриламид (18)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.64 (широкий, 1H), 10,62 (с, 1H), 8,37 (д, J = 2,4 Гц, 1H), 8,35 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,14 (дд, J = 2,4, 9 Гц, 1H ), 7,94 (д, J = 9,0 Гц, 2H), 7,84 (д, J = 9,0 Гц, 1H), 7,77 (м, 1H), 7,63 (д, J = 15,9 Гц, 1H), 7,57–7,53 (м , 2H), 6,87 (д, J = 15,6 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₄ F ₂ N ₄ O ₄], 436,38; найдено 437,15 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- p -толил-акриламид (20 )

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.63 (с, 1H), 10,52 (с, 1H), 8,37 (д, J = 2,4 Гц, 1H), 8,35 (д, J = 9 Гц, 2H), 8,13 (дд, J = 2,1, 8,7 Гц, 1H ), 7,94 (д, J = 9 Гц, 2H), 7,83 (д, J = 9 Гц, 1H), 7,61 (д, J = 15,9 Гц, 1H), 7,55 (д, J = 8,1 Гц, 2H), 7,28 (д, J = 7,8 Гц, 2H), 6,83 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 2,35 (с, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₈ N ₄ O ₄], 414,42; найдено 415,15 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (2-метоксифенил) акриламид (21)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.58 (с, 1H), 10,46 (с, 1H), 8,30 (д, J = 2,0 Гц, 1H), 8,29 (д, J = 8,6 Гц, 2H), 8,08 (дд, J = 2,2, 8,9 Гц, 1H ), 7,89 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,81 (д, J = 14,4 Гц, 1H), 7,77 (д, J = 8,8 Гц, 1H), 7,56 (д, J = 7,6 Гц, 1H), 7,37 (т, J = 8,3 Гц, 1H), 7,07 (д, J = 8,3 Гц, 1H), 6,99 (т, J = 7,5 Гц, 1H), 6,88 (д, J = 15,8 Гц, 1H), 3,86 ( с, 3Н). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₈ N ₄ O ₅], 430,42; найдено 431,14 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-метоксифенил) акриламид (22)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.57 (с, 1H), 10,40 (с, 1H), 8,31 (д, J = 2,3 Гц, 1H), 8,28 (д, J = 9,0 Гц, 2H), 8,08 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H ), 7,88 (д, J = 8,9 Гц, 2H), 7,77 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,56 (д, J = 9,0 Гц, 2H), 7,55 (д, J = 14,6 Гц, 1H), 6,97 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 6,68 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 3,76 (с, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₈ N ₄ O ₅], 430,42; найдено 431,14 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (2,4-Диметоксифенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -акриламид (24)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.62 (brs, 1H), 10,43 (с, 1H), 8,36 (д, J = 2,4 Гц, 1H), 8,33 (д, J = 9 Гц, 2H), 8,13 (дд, J = 2,1, 9 Гц, 1H ), 7,94 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 7,83 (д, J = 9 Гц, 1H), 7,78 (д, J = 16,8 Гц, 1H), 7,54 (д, J = 8,4 Гц, 1H), 6,81 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 6,65–6,62 (м, 2H), 3,91 (с, 3H), 3,83 (с, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₄ H ₂₀ N ₄ O ₆], 460,45; найдено 461,25 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-изопропилфенил) акриламид (25)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.64 (шир. С, 1H), 10,54 (с, 1H), 8,36 (шир. С, 1H), 8,35 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,12 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H), 7,93 ( д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,81 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,62 (д, J = 15,5 Гц, 1H), 7,58 (д, J = 8,0 Гц, 2H), 7,34 (д, J = 8,1 Гц, 2H), 6,84 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 2,93 (м, J = 6,9 Гц, 1H), 1,23 (дд, J = 6,9 Гц, 6H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₅ H ₂₂ N ₄ O ₄], 442,48; найдено 443,26 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-Диметиламинофенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] акриламид (26)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.61 (с, 1H), 10,28 (с, 1H), 8,29 (д, J = 2,0 Гц, 1H), 8,27 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,07 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H ), 7,86 (д, J = 8,9 Гц, 2H), 7,76 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,48 (д, J = 15,5 Гц, 1H), 7,42 (д, J = 8,9, 2H), 6,71 (д, J = 8,9, 2H), 6,55 (д, J = 15,5 Гц, 1H), 2,93 (с, 6H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₄ H ₂₁ N ₅ O ₄], 443,47; найдено 444,14 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [5- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) пиридин-2- ил] -акриламид (30)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.81 (с, 1H), 11,10 (с, 1H), 9,27 (д, J = 1,8 Гц, 1H), 8,71 (дд, J = 2,4, 8,7 Гц, 1H), 8,47 (д, J = 9,0 Гц, 1H) ), 8,41 (д, J = 1,8 Гц, 1H), 8,15 (дд, J = 2,4, 8,7 Гц, 1H), 7,87 (д, J = 9,0 Гц, 1H), 7,73–7,68 (м, 3H), 7,32 (т, J = 8,7 Гц, 2H), 7,03 (д, J = 15,6 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₁ H ₁₄ F ₁ N ₅ O ₄], 419,38; найдено 420,10 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [6- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) -пиридин-3- ил] -акриламид (31)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.83 (шир. С, 1H), 10,79 (с, 1H), 9,09 (шир. С, 1H), 8,42–8,33 (м, 3H), 8,16 (дд, J = 1,8, 8,7 Гц, 1H), 7,88 (д, J = 8,7 Гц, 1H), 7,75 (дд, J = 5,4, 8,4 Гц, 2H), 7,70 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 7,32 (т, J = 8,7 Гц, 2H), 6,82 (д, J = 15,6 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₁ H ₁₄ F ₁ N ₅ O ₄], 419,38; найдено 420,15 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [3-Фтор-4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-фтор- фенил) акриламид (33)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.47 (с, 1H), 10,72 (с, 1H), 8,39 (д, J = 2,1 Гц, 1H), 8,17 (дд, J = 2,2, 8,9 Гц, 1H), 7,99–7,84 (м, 1H), 7,88 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,76–7,56 (м, 4H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,80 (д, J = 15,7 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₄ F ₂ N ₄ O ₄], 436,38; найдено 437,15 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) -2-метил- фенил] акриламид (34)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.68 (с, 1H), 9,58 (с, 1H), 8,36 (д, J = 2,2 Гц, 1H), 8,22–8,18 (м, 2H), 8,13 (дд, J = 2,3, 8,9 Гц, 1H), 8,03 (дд, J = 8,4 Гц, 1H), 7,83 (д, J = 8,9 Гц, 1H), 7,73 (дд, J = 5,6, 8,7 Гц, 2H), 7,64 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 7,05 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 2,41 (с, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₇ F ₁ N ₄ O ₄], 432,41; найдено 433,10 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-5-метил-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) — фенил] акриламид (36)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.59 (с, 1H), 10,52 (с, 1H), 8,31 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,17 (с, 1H), 7,91 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,75–7,62 (м , 4H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,82 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 2,63 (с, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₇ F ₁ N ₄ O ₄], 432,41; найдено 433,10 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (6-Циано-1-гидрокси-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-фторфенил) акриламид (45)

¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.44 (шир. С, 1H), 10,53 (с, 1H), 8,31 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 8,08 (шир. С, 1H), 7,92 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,81 (д, J = 8,4 Гц, 1H), 7,75-7,60 (м, 4H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,83 (д, J = 15,7 Гц, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₃ H ₁₅ F ₁ N ₄ O ₂], 398,40; найдено 399,17 [M + H] ⁺.

(

E ) -3- (4-фторфенил) — N — [4- (1-гидрокси-6-пиразол-1-ил-1 H -бензоимидазол-2-ил) — фенил] акриламид (50)

К раствору 4-аминобензиламина (35.4 мл, 313 ммоль) и порошкообразного NaHCO ₃ (158 г, 1875 ммоль) в безводном ДМФ (500 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 4-бром-1-фтор-2-нитробензола (31,4 мл, 250 мл). ммоль) в безводном ДМФ (50 мл) по каплям через капельную воронку в течение 1 часа. Еще через 4 часа раствор разбавляли безводным абсолютным EtOH (1000 мл) и порциями добавляли порошкообразный KO ^t Bu (140 г, 1250 ммоль). Затем этот раствор нагревали до 60 ° C в течение 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры раствор выливали в перемешиваемый водный раствор (4 л), а затем доводили до pH 6 с помощью 1M HCl.Медленно перемешиваемую суспензию охлаждали на ледяной бане для облегчения затвердевания. Суспендированный продукт собирали на воронке с тонкой фриттой и промывали водой до тех пор, пока элюент не стал бесцветным. Оранжевое твердое вещество дополнительно сушили в высоком вакууме. В сосуд для микроволновой печи Biotage объемом 20 мл загружали 6-бром-2- (4-аминофенил) -1-гидроксибензимидазол (1,5 г, 5,0 ммоль), N, N ‘-диметилэтилендиамин (1,1 мл, 10,0 ммоль), CuI (0,9 г, 5,0 ммоль), пиразола (1,4 г, 20,0 ммоль) и KO ^t Bu (2.3 г, 20,0 ммоль) и безводный ДМСО (20 мл). Защищенный флакон помещали в микроволновый реактор Biotage с установленной температурой 195 ° C на 45 мин. После охлаждения флакон открывали и выливали в быстро перемешиваемый водный раствор. Полученную суспензию фильтровали через пробку из Celite®, промывая 0,5 М NaOH. Водный раствор загружали в подготовленную колонку DVB. После загрузки продукт элюировали ацетонитрилом. Ацетонитрил удаляли при пониженном давлении. Полученный водный раствор охлаждали до 0 ° C на ледяной бане, а затем pH раствора доводили до 6 с помощью 1 M HCl для осаждения продукта.Полученное твердое вещество собирали и промывали холодной водой. После дополнительной сушки в вакууме получали продукт 50 в виде светло-коричневого твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,22 (широкий, 1H), 10,50 (с, 1H), 8,59 (с, 1H), 8,26 (д, J = 8,1 Гц, 2H), 7,93 (с, 1H), 7,90 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 7,75–7,66 (м, 5H), 7,63 (д, J = 15,9 Гц, 1H), 7,29 (т, J = 8,4 Гц, 2H ), 6,82 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 6,55 (с, 1H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₅ H ₁₈ F ₁ N ₅ O ₂], 439.45; найдено 440,20 [M + H] ⁺.

Метод B. Общий синтез производных 4-фениламидобензиламина (7)

К раствору производного 4-цианоанилина (225 ммоль) в пиридине или N -метилпирролидоне (180 мл) добавляли коричный хлорид (225 ммоль). ) в течение 3-5 минут при интенсивном перемешивании. После перемешивания реакционной смеси в течение 5 часов (до тех пор, пока ВЭЖХ-мониторинг реакции не указывал на полное израсходование исходных материалов), ее выливали в 1400 мл воды при комнатной температуре и полученную суспензию перемешивали в течение 1 часа.Осадок фильтровали, промывали водой 4 порциями по 500 мл и сушили. Вторую порцию твердого вещества получали из фильтрата и промывок. Твердые вещества объединяли и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. В реакторе под давлением промежуточный 4-фениламидобензонитрил (98 ммоль) растворяли в безводном ТГФ (940 мл), и раствор продували аргоном в течение 2–3 минут с последующим добавлением 11 мл однородно суспендированного катализатора ( Ренея ^® никель 2400, суспензия в воде).После добавления к суспензии небольшого количества МеОН в реакторе создавали давление H ₂, равное 55 фунтам на квадратный дюйм, при интенсивном перемешивании. Мониторинг реакции с помощью ЖХ-МС показал полное превращение исходного материала в соответствующий амин в течение 2,5 часов. Реакционную смесь фильтровали через слой диатомовой земли (например, Celite ^®) и промывали 3 порциями по 100 мл безводного ТГФ. Объединенные фильтраты упаривали досуха и дополнительно сушили в высоком вакууме с получением 7 в виде твердого вещества белого цвета.Неочищенный продукт использовали на следующем этапе без дополнительной характеристики.

(

E ) — N — {4 — [(5-Фтор-2,4-динитрофениламино) метил] фенил} -3-фенилакриламид (8)

К раствору 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (0,8 г, 3,9 ммоль) в 30 мл ДМФ, добавляли бикарбонат натрия (3,3 г, 39 ммоль) и промежуточное соединение 7 (1,5 г, 3,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, а затем выливали в ледяную воду с получением осадка.Осадок фильтровали, промывали водой и сушили в вакууме с получением желаемого продукта 8 (1,6 г, выход 90%). Этот материал использовали на следующем этапе без дополнительной очистки. ¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 10,21 (с, 1H), 9,40 (т, J = 6 Гц, 1H), 8,89 (д, J = 8,1 Гц, 1H) , 7,71-7,66 (м, 4H), 7,58 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 7,37 (д, J = 8,4 Гц, 2H), 7,28 (т, J = 8,7 Гц, 2H), 7,00 (д, J = 15 Гц, 1H), 6,76 (д, J = 15,6 Гц, 1H), 4,70 (д, J = 6 Гц, 2H).МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₂ H ₁₆ F ₂ N ₄ O ₅], 454,39; найдено 455,15 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (5-этокси-1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-фтор- фенил) акриламид (37)

К раствору 8 (0,2 г, 0,4 ммоль) в EtOH (10 мл) и ДМФ (10 мл) добавляли NaH (60% мас. / мас. в минеральном масле) ( 88 мг, 2,2 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 60 ° C в течение 3 часов.После охлаждения до комнатной температуры его выливали в ледяную воду и подкисляли водной лимонной кислотой. Полученные осадки собирали, промывали водой и очищали препаративной ВЭЖХ. Фракции, показавшие чистоту> 95% по данным аналитической ВЭЖХ, объединяли, и летучие вещества упаривали в вакууме. Полученное твердое вещество собирали и промывали водой. После сушки в вакууме получали продукт 37 в виде желтого твердого вещества. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12.41 (с, 1H), 10,51 (с, 1H), 8,29 (д, J = 8,7 Гц, 2H), 8,05 (с, 1H), 7,91 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,72 (дд, J = 5,7, 8,5 Гц, 2H), 7,65 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 7,50 (с, 1H), 7,30 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,82 (д, J = 15,7 Гц, 1H ), 4,22 (qr, J = 6,9 Гц, 2H), 1,37 (т, J = 6,9 Гц, 3H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₄ H ₁₉ F ₁ N ₄ O ₅], 462,44; найдено 463,15 [M + H] ⁺.

(

E ) — N — [4- (5-Диметиламино-1-гидрокси-6-нитро-1 H -бензоимидазол-2-ил) фенил] -3- (4-фтор- фенил) акриламид (39)

К раствору 8 (0.9 г, 2 ммоль) в ДМФ (50 мл), добавляли NaHCO ₃ (1,7 г, 20 ммоль), а затем 4 мл 2,0 М раствора диметиламина в ТГФ (8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 3 ч реакционную смесь выливали в воду (500 мл). После фильтрации собранное твердое вещество промывали водой и сушили в вакууме, получая ( E ) — N — {4 — [(5-Диметиламино-2,4-динитрофениламино) метил] фенил. } -3- (4-фторфенил) акриламидное промежуточное соединение в виде желтого твердого вещества (0,8 г, выход 84%). Этот сырой материал был использован на следующем этапе.К раствору вышеупомянутого промежуточного соединения (0,8 г, 1,7 ммоль) в ДМФ (30 мл) добавляли NaOMe (30% мас. / Мас. В МеОН) (1,5 г, 8,4 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 60 ° C в течение 3 часов. После охлаждения до комнатной температуры его выливали в ледяную воду и подкисляли водной лимонной кислотой. Полученный осадок собирали, промывали водой и очищали препаративной ВЭЖХ. Фракции, показавшие чистоту более 95% по данным аналитической ВЭЖХ, объединяли и концентрировали. Полученное твердое вещество собирали и промывали водой.После сушки в вакууме получали продукт 39 в виде желтого твердого вещества. ¹ H ЯМР (300 МГц, ДМСО- d ₆): δ 12,32 (с, 1H), 10,52 (с, 1H), 8,28 (д, J = 8,8 Гц, 2H), 7,98 (с, 1H), 7,91 (д, J = 8,9 Гц, 2H), 7,74–7,70 (м, 2H), 7,65 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 7,49 (с, 1H), 7,31 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 6,82 (д, J = 15,7 Гц, 1H), 2,75 (с, 6H). МС (ESI, положительный): вычислено для [C ₂₄ H ₂₀ F ₁ N ₅ O ₄], 461.46; найдено 462,15 [M + H] ⁺.

Анализ бесклеточного связывания LcrF-ДНК

Биотинилированную двухцепочечную молекулу ДНК (2 нМ), содержащую связывающие последовательности LcrF, инкубировали с 6His-LcrF (20 нМ) в 96-луночном микротитровальном планшете, покрытом стрептавидином ( Thermo Lab Systems, Waltham, MA) в присутствии различных концентраций ингибитора и в буфере для анализа (20 мМ Hepes, 10 мМ сульфата аммония, 30 мМ хлорида калия, 1 мМ EDTA, 0,2% полисорбат 20 и 0,5% не -жирное сухое молоко).Несвязавшуюся ДНК и белок удаляли промыванием, а затем добавляли первичное моноклональное антитело против 6His. Связанные комплексы ДНК-белок детектировались вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), действующим на субстрат хемилюминесценции (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс). Люминесценцию измеряли на планшет-ридере Victor V (PerkinElmer Life Sciences, Веллесли, Массачусетс). Данные люминесценции преобразовывали в% ингибирования связывания LcrF по сравнению с контрольными лунками. Данные% ингибирования связывания LcrF для каждого титрования тестируемого соединения наносили на график в Microsoft Excel, и XLfit (IDBS) использовали для подбора кривой доза-ответ и представляли как IC ₅₀ (концентрация тестируемого соединения, которая ингибировала связывание LcrF на 50%).Анализы связывания ExsA-ДНК и SlyA-ДНК проводили с использованием аналогичной процедуры. Данные представляют собой средние значения из двух независимых экспериментов для большинства соединений. Данные IC ₅₀ для соединений 10 , 14 , 17 , 24 , 26 , 45 и 52 представляют собой медианные значения по крайней мере трех независимых экспериментов (см. Вспомогательную информацию) .

Анализ целых клеток: ингибирование цитотоксичности

Yersinia в J774A.1 макрофаги

Анализ цитотоксичности был основан на протоколе Monack et al . описано ранее. ²⁴ Макрофаги J774A.1 высевали по 2 × 10 ⁴ клеток на лунку в 96-луночные планшеты за день до инфицирования. Ночные культуры дикого типа (YPIIIpIB1) ²³ или мутант с делецией lcrF (YPIIIpIB1Δ lcrF ) ²⁵ штаммов Y. pseudotuberculosis разводили в 2-YT бульоне с добавлением 20 мкМ хлорида магния. мМ оксалат натрия.Культуры выращивали в течение 90 минут при 26 ° C, а затем переводили на 37 ° C на 90 минут, чтобы вызвать экспрессию LcrF. Бактерии добавляли к клеткам в среде DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) и инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 2 часов. Множественность заражения составляла 5-10 бактерий на клетку J774A.1. Гентамицин добавляли в концентрации 50 мкг / мл для уничтожения внеклеточных бактерий, и инкубацию продолжали в течение ночи (~ 18 ч). Супернатанты, содержащие высвобожденную ЛДГ (лактатдегидрогеназу), свидетельствующую о гибели клеток, анализировали колориметрически с использованием набора Cytox 96® от Promega (Мэдисон, Висконсин).Тестируемые соединения в концентрации 50 мкг / мл добавляли в культуральную среду Yersinia и в лунки для клеток J774A.1 во время инфекций. Контрольные культуры и лунки получали равный объем носителя (ДМСО с 0,4% этаноламином). Результаты выражены в% цитотоксичности дикого типа (количество ЛДГ, высвобожденное в лунки, инфицированные диким типом Y. pseudotuberculosis , в присутствии одного носителя).

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам in vitro

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) тестируемых соединений определяли с использованием методологии Института клинических лабораторных стандартов (CLSI).⁴¹ В каждый день тестирования готовили серийные разведения соединений в планшетах для микроразведений с использованием роботизированной рабочей станции Tecan. Культуры штаммов в бульоне Мюллера-Хинтона выращивали или доводили до уровня мутности 0,5 стандарта МакФарланда. Разведения 1: 100 делали в соответствующем бульоне для достижения конечного посевного материала 5 × 10 ⁵ клеток / мл. Планшеты инкубировали при 35 ° C на воздухе в течение 18–24 ч, считывали спектрофотометрически и вручную проверяли на наличие бактерий.Наименьшее разведение соединения, которое ингибировало рост бактерий, регистрировали как MIC.

Анализ связывания ДНК in vitro

Для оценки неспецифического связывания ДНК тестировали влияние соединений на миграцию суперспиральной плазмидной ДНК во время электрофореза в агарозном геле. Соединения разбавляли в ДМСО с 0,4% этаноламином до концентрации 1 мг / мл. В прозрачном 96-луночном планшете 2 мкл раствора соединения 1 мг / мл добавляли к 18 мкл буфера для анализа (20 мМ Hepes, pH 7.6, 10 мМ сульфата аммония, 30 мМ хлорида калия, 1 мМ ЭДТА, 0,2% полисорбат-20), содержащий 100 нг сверхспиральной плазмидной ДНК pET-15b. Таким образом, конечная концентрация тестируемых соединений составляла 100 мкг / мл. Планшет инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Десять микролитров растворов соединения и ДНК наносили на 0,8% агарозный гель и подвергали электрофорезу. Затем гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали. Контрольные тесты с лекарственным носителем (ДМСО с 0,4% этаноламином) не влияли на миграцию ДНК через гель.Напротив, тесты с 100 мкг / мл положительного контроля красителя Hoechst 33342, известного интеркалятора ДНК, привели к слабому мазку на геле, а не к дискретным полосам, наблюдаемым при электрофорезе невозмущенной ДНК.

LcrQ блокирует роль LcrF в регуляции генов секреции Ysc-Yop типа III у Yersinia pseudotuberculosis

Abstract

Патогенные виды Yersinia используют систему секреции Ysc-Yop типа III (T3SS), кодируемую высококонсервативной плазмидой вирулентности pYV, для экспорта эффекторов вирулентности в клетки-хозяева.Ysc-Yop T3SS жестко регулируется множеством белков, которые функционируют на разных уровнях. Однако систематический анализ регуляции транскрипции Ysc-Yop T3SS отсутствует, и подробный механизм этого процесса регуляции все еще неуловим. Стремясь систематически охарактеризовать регуляцию транскрипции всех генов T3SS в Y. pseudotuberculosis , мы амплифицировали 97 некодирующих фрагментов плазмиды pYV и проанализировали транскрипционные ответы генов T3SS в различных условиях роста.Транскрипция генов T3SS индуцировалась при 37 ° C, а гены, кодирующие эффекторы T3SS, были сильно индуцированы дальнейшим истощением Ca ²⁺. Процесс транскрипции гена, индуцированный температурой, опосредуется модулями, кодируемыми на хромосоме, в то время как процесс, вызванный истощением Ca ²⁺, контролируется положительным регуляторным белком LcrF, а также отрицательным регуляторным белком LcrQ. В этом процессе LcrQ имеет те же цели, что и LcrF, и эффект LcrQ зависит от присутствия LcrF.Кроме того, сверхэкспрессия LcrF показала тот же фенотип, что и у мутантного штамма lcrQ , и баланс внутриклеточных количеств LcrQ и LcrF важен для регуляции T3SS. Когда уровень экспрессии LcrF превышает LcrQ, активируется экспрессия генов Ysc-Yop T3SS и , наоборот, . Вместе эти данные подтверждают модель, в которой LcrQ блокирует активационную роль LcrF в регуляции транскрипции генов T3SS в Yersinia .

Образец цитирования: Li L, Yan H, Feng L, Li Y, Lu P, Hu Y, et al.(2014) LcrQ блокирует роль LcrF в регуляции генов секреции Ysc-Yop типа III у Yersinia pseudotuberculosis . PLoS ONE 9 (3): e. https://doi.org/10.1371/journal.pone.00

Редактор: Дипшиха Чакравортти, Индийский институт науки, Индия

Поступила: 4 декабря 2013 г .; Принята к печати: 18 февраля 2014 г .; Опубликован: 21 марта 2014 г.

Авторские права: © 2014 Li et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Финансируется Национальным научным фондом Китая (№ 31170133). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Род Yersinia включает три вида патогенных бактерий человека: Y. pestis , Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis . Эти патогены содержат консервативную плазмиду вирулентности, называемую pYV (или pCD), которая кодирует систему секреции Ysc-Yop типа III (T3SS) [1]. При контакте с клетками-хозяевами патогенная Yersinia может эффективно вводить эффекторы, называемые Yops (внешние белки Yersinia ), в эукариотические клетки-хозяева с этой системой секреции.Эти перемещенные Yops позволяют бактериям уклоняться от иммунных ответов хозяина, модулируя сигнальные пути клетки-хозяина, и способствуют следующей инфекции [1] — [3].

Ysc-Yop T3SS в Yersinia регулируется как положительно, так и отрицательно и индуцируется условиями с низким содержанием Ca ²⁺ при 37 ° C in vitro или прямым контактом с клетками-хозяевами in vivo [4], [5]. В процесс негативного регулирования вовлечены несколько регулирующих органов. Белок LcrQ (или гомологи YscM1 и YscM2 в Y.enterocolitica ) представляет собой антиактиватор, который вызывает ингибирование по обратной связи для экспрессии гена Ysc-Yop T3SS. Этот белок секретируется вне клеток секреторным аппаратом в условиях низкого содержания Ca ²⁺ при 37 ° C с помощью белка-шаперона, названного SycH [6] — [8]. Этот процесс снимает репрессивный эффект LcrQ и приводит к активации Ysc-Yop T3SS [7]. Мы также недавно охарактеризовали роль компонента экспортного аппарата, названного YscV, в секреции LcrQ и последующей регуляции Ysc-Yops T3SS [9].Однако цели и роль LcrQ во время этого регуляторного процесса еще полностью не проиллюстрированы. Помимо LcrQ, другие негативные регуляторные элементы, включая SycN, YscB, YopN, TyeA и оперон lcrGVH-yopBD , также были продемонстрированы, чтобы играть важную роль в регуляции экспрессии гена T3SS [10] — [14].

Активатор семейства AraC LcrF (известный как VirF в Y. enterocolitica ) — единственный белок плазмиды pYV, который положительно регулирует транскрипцию генов T3SS [15].LcrF непосредственно связывается с промоторными областями нескольких генов yop , а также связывается с РНК-полимеразой, как предполагают белки семейства AraC [16]. При таких взаимодействиях LcrF усиливает связывание РНК-полимеразы со специфическими промоторами, чтобы облегчить инициацию транскрипции. Транскрипция ряда генов из плазмиды pYV, например, оперонов ylpA, yadA , yopE , yopH , virC и lcrGVHyopBD , зависит от LcrF [17] — [20].Прямое связывание LcrF с yopE , yopH, virC и lcrGVHyopBD подтверждено, и участок, богатый AT ∼40 п.н. в каждом из этих промоторов, характеризуется распознаванием LcrF [20].

Ysc-Yop T3SS в Yersinia регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. LcrF — классический активатор, контролирующий экспрессию гена T3SS на уровне транскрипции [20]. YopD — еще один регулятор, который связывается с мРНК нескольких генов yop для ускорения деградации мРНК или ингибирования связывания рибосом при трансляции генов [21], [22], которая действует на посттранскрипционном уровне.Экспрессия lcrF также регулируется на посттранскрипционном уровне. Структура мРНК вокруг рибосомальной связывающей области транскрипта lcrF открывается при изменении температуры с 26 ° C на 37 ° C [23], что облегчает трансляцию гена. Некоторые другие регуляторы, такие как комплекс YopN-TyeA, также действуют на посттрансляционном уровне, ингибируя процесс секреции T3SS [13], [24]. Хотя LcrQ негативно регулирует экспрессию генов T3SS, он лишен очевидных ДНК или РНК-связывающих доменов и не действует, блокируя канал секреции [25], таким образом, регуляторный механизм LcrQ полностью не изучен.

В этом исследовании мы систематически анализировали ответы каждого гена на плазмиду pYV на уровне транскрипции при различных условиях роста в штамме Y. pseudotuberculosis YPIII. Путем сравнения активности каждого промотора были охарактеризованы транскрипционные ответы генов Ysc-Yop T3SS. Роль LcrQ в регуляции генов Ysc-Yop T3SS на уровне транскрипции была впоследствии проанализирована, и его взаимодействие с LcrF в этом процессе регуляции транскрипции было дополнительно исследовано и обсуждено.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, плазмиды, питательные среды и олигонуклеотиды

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, обобщены в Таблице 1 . Yersinia pseudotuberculosis штаммов YPIII выращивали в среде YLB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), а штаммов E. coli выращивали в среде Лурия-Бертани (LB). При необходимости использовали антибиотики в следующих концентрациях: налидиксовая кислота (Nal) 15 мкг мл ^-1, хлорамфеникол 30 мкг мл ^-1, ампициллин 100 мкг мл ^-1, канамицин 100 мкг мл ^-1 .Все олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в Table S1 .

Клонирование промотора и анализ β-галактозидазы

Последовательность плазмиды вирулентности pYV в штамме Y. pseudotuberculosis YPIII недоступна. Мы собрали и проанализировали доступные последовательности плазмид вирулентности различных штаммов Y. pseudotuberculosis из базы данных NCBI, например, pYV из IP 32953 (NC_006153.2) и IP 31758 (NC_009704.1), pYPTS01 из штамма PB1 + (NC_010635.1). В плазмиде pYV из IP32953 имеется 99 аннотированных генов, 66 генов из IP31758 и 87 генов в pYPTS01 из штамма PB1 +. Чтобы охватить все возможные гены, мы выбрали последовательность плазмиды pYV из IP32953 в качестве матрицы для конструирования праймеров (, таблица S1, ) для клонирования некодирующих фрагментов плазмиды pYV в YPIII. Все эти амплифицированные некодирующие фрагменты были клонированы в вектор клонирования промотора pZT100 [9]. Эти клоны были соответственно трансформированы в YPIII или его производные штаммы, и анализ β-галактозидазы проводили, по крайней мере, в трех повторностях, как описано ранее [26], при 26 ° C, 37 ° C или 37 ° C с истощением Ca ²⁺.

Выделение РНК и ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК штаммов Yersinia , культивированных при 26 ° C, 37 ° C или 37 ° C с истощением Ca ²⁺, экстрагировали реагентом TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. После обработки ДНКазой I, свободной от РНКазы (Promerga), кДНК получали обратной транскрипцией (Random 9 mers, TaKaRa) с использованием 2 мкг каждого образца РНК. ПЦР в реальном времени выполняли в реакциях, содержащих 1 × iTaq ™ Universal SYBR Green Supermix Reagent (Bio-Rad), матрицы кДНК и специфичные для генов праймеры с использованием системы CFX Connect Bio-Rad.Все эти анализы были протестированы в двух экземплярах. Уровень мРНК в каждом образце нормализовали до уровня транскрипта гена 16S рРНК, а специфичность амплификации оценивали с помощью анализа кривой плавления. Степени изменения экспрессии рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCt.

Анализ задержки гелеобразования

Замедление гелеобразования выполняли, как описано ранее [26]. Белок LcrF был экспрессирован в E.coli BL21 (DE3) плазмидой pET28a, несущей ген lcrF из YPIII (названный pET28a-LcrF), и очищен смолой Ni-NTA.Около 400 нг каждого фрагмента ДНК, который был амплифицирован из геномной ДНК YPIII, инкубировали с различными количествами очищенного белка LcrF в 20 мкл связывающего буфера (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 4 мМ MgCl ₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 10% глицерин и 100 нг бычьего сывороточного альбумина). Фрагмент размером ~ 200 п.н., амплифицированный из некодирующей области выше гена pYV0053, использовали в качестве отрицательного контроля. Связывание зондов проводили при 37 ° C в течение 1 ч, а затем наносили на 6,5% природный полиакриламидный гель.Электрофорез проводили в буфере 0,5 × TBE на льду. Гель окрашивали бромидом этидия в течение 20 мин и сканировали с использованием системы документации гелей Syngene GeneGenius.

Конструирование и дополнение мутантов

Для конструкции Δ lcrF два фрагмента ДНК, фланкирующие ген lcrF , амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК YPIII с использованием двух пар праймеров: названных LcrF-in-upF / R и LcrF-in-downF / R. ( Таблица S1 ). Эти два фрагмента смешивали и затем использовали в качестве матричной ДНК во втором раунде ПЦР с праймерами LcrF-in-upF и LcrF-in-downR.Продукт ПЦР расщепляли Sal I и Bgl II и вставляли в суицидную плазмиду pDM4 [27]. Этой рекомбинантной плазмидой трансформировали E. coli S17-1 и проводили трансконъюгацию, как описано [27], для получения штамма Δ lcrF . Чтобы дополнить Δ lcrF , была сконструирована плазмида, названная pOVR200, которая содержит репликон pMB1, ген bla и ген lacI из pET21a (Novagen) и промотор lac перед множественным сайтом клонирования.Ген lcrF амплифицировали с помощью ПЦР из YPIII и клонировали в pOVR200 для получения pOVR-LcrF, который трансформировали в Δ lcrF . Плазмиду pOVR200 также трансформировали в Δ lcrF в качестве контроля.

Сверхэкспрессия и коэкспрессия LcrF и LcrQ

Плазмиду pOVR-LcrF, полученную выше, трансформировали в YPIII для сверхэкспрессии белка LcrF. Чтобы сверхэкспрессировать белок LcrQ, ген lcrQ амплифицировали из YPIII и клонировали в pOVR200, чтобы получить pOVR-LcrQ, который трансформировали в YPIII.Для совместной экспрессии LcrF и LcrQ (или GST-LcrQ) для совместной экспрессии целевых белков использовали низкокопийную плазмиду pKT100 [26], которая содержит репликон P15A, совместимый с pOVR200, и промоторную область гена устойчивости к хлорамфениколу. с плазмидой pOVR200.

Анализ Yops

Ночные культуры штаммов Yersinia , выращенных на обогащенной среде Ca ²⁺ (YLB с 2,5 мМ Ca ²⁺), разбавляли (1:20) свежей обедненной Ca ²⁺ средой (YLB, содержащей 5 мМ EGTA и 20 мМ MgCl (₂) [28] и инкубировали при 26 ° C в течение 1 ч, затем повышали температуру до 37 ° C, чтобы вызвать экспрессию и секрецию Yops.При необходимости в культуры добавляли изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ перед изменением температуры. После 4 ч инкубации при 37 ° C собирали 20 мл каждой культуры и центрифугировали. Измеряли влажную массу осадка бактериальных клеток, супернатант собирали и фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Millipore). Белки из супернатанта осаждали в течение ночи при 4 ° C 10% трихлоруксусной кислотой, как описано [9]. Белки как супернатантов, так и осадка растворяли в загрузочном буфере SDS в соответствии с сырым весом бактерий и разделяли с помощью SDS-PAGE.Был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения белков после SDS-PAGE. Меченые пероксидазой хрена антикроличьи антитела и набор для обнаружения хемилюминесценции (Beyotime Institute of Biotechnology) использовали для разработки реакции в соответствии с протоколом, предоставленным производителем.

Плазмида pYV, излечивающая

Плазмида pYV в YPIII была излечена, как описано другими [29]. Вкратце, штамм YPIII выращивали на планшете YLB с добавлением 20 мМ оксалата натрия, 20 мМ MgCl ₂ и 0.05% краситель Конго красный при 37 ° C. Белые колонии собирали и культивировали в течение ночи в среде YLB, а затем наносили на чашку Congo Red. После ночного культивирования при 37 ° C единственная белая колония (потеря функциональной плазмиды pYV приводит к белым колониям) была выбрана для ПЦР, чтобы дополнительно подтвердить, что плазмида pYV была излечена с использованием пяти пар праймеров, которые были спарены с различными областями на плазмида pYV.

Бактериальный двугибридный анализ

Бактериальная двугибридная система на основе аденилатциклазы [30] была применена для анализа взаимодействия между белками LcrF и LcrQ.Вкратце, плазмиду pKT25, несущую фрагмент Т25, использовали для клонирования генов lcrF и sycH для получения T25-LcrF и T25-SycH. PUT18, несущий фрагмент T18, применяли к генам клона lcrF и lcrQ для получения T18-LcrF и T18-LcrQ. Эти две пары плазмид котрансформировали в E. coli BTh201 и культивировали в среде LB с 1 мМ IPTG при 30 ° C в течение 2 дней. Активность β-галактозидазы определяли, как описано [26].

Статистический анализ

Все данные для анализов активности β-галактозидазы представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) результатов нескольких независимых экспериментов.Тест Стьюдента использовался для сравнения данных между двумя соответствующими группами.

Результаты

Транскрипционные ответы генов T3SS в индуцибельных условиях

Чтобы систематически охарактеризовать транскрипционные ответы генов Ysc-Yop T3SS в YPIII в условиях, индуцируемых T3SS, мы сравнили промоторные активности всех генов плазмиды pYV. Используя праймеры, созданные из штамма Y. pseudotuberculosis IP 32953, мы успешно амплифицировали 96 некодирующих областей плазмиды pYV в YPIII.Не удалось получить только три области перед pYV0042, pYV0043 и pYV0044. Затем мы секвенировали область от pYV0041 до pYV0045, в YPIII были обнаружены делеция на С-конце кодирующей области pYV0041 и полная делеция генов pYV0042 и pYV0043. Используя эту новую последовательность, мы разработали другую пару праймеров для амплификации некодирующей области pYV0044. Всего было амплифицировано 97 некодирующих фрагментов и клонировано в репортерный вектор lacZ для получения слияния некодирующий фрагмент lacZ .Затем были проанализированы промоторные активности этих некодирующих фрагментов в условиях, не индуцируемых T3SS (26 ° C и 37 ° C) и индуцибельных (37 ° C с истощением Ca ²⁺). Как показано на фиг. 1A , 68 из 97 некодирующих фрагментов показали промоторную активность по сравнению с плазмидой pZT100 (202 ± 12, p <0,01) по меньшей мере при одном условии. Мы также сравнили промоторные активности этих 68 некодирующих фрагментов при 26 ° C и 37 ° C, что является одним из ключевых факторов, индуцирующих T3SS in vitro .Как показано на Fig. 1B , 34 из 68 промоторов показали более высокую (более чем в 2 раза) активность при 37 ° C, предполагая, что некоторые факторы активируют экспрессию генов T3SS, когда бактериальные клетки были сдвинуты с 26 ° C на 37 ° C.

Фигура 1. Анализ промоторной активности генов плазмиды pYV в YPIII.

(A) Промоторные активности 99 некодирующих фрагментов при 26 ° C, 37 ° C или 37 ° C с истощением Ca ²⁺. Фрагменты с относительной промоторной активностью выше, чем у плазмиды pZT100 (202 ± 12, p <0.01) при одном из этих условий были отмечены красной точкой. (B) и (C) Относительные промоторные активности выбранных фрагментов в штаммах YPIII и ΔpYV при 26 ° C и 37 ° C (B) или при 37 ° C с истощением Ca ²⁺ по сравнению с 37 ° C (C).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.g001

Чтобы проверить, кодируются ли эти факторы генами плазмиды pYV, мы затем сравнили эту активацию в родительском штамме YPIII со штаммом, вылеченным плазмидой pYV (ΔpYV ). Наши результаты показали, что индуцированные складки при 37 ° C для всех этих промоторов аналогичны между родительскими штаммами YPIII и штаммами ΔpYV ( рис.1B ), что предполагает, что активация при 37 ° C в значительной степени опосредуется факторами, кодируемыми на хромосоме. Чтобы полностью охарактеризовать транскрипционный ответ во время процесса индукции T3SS, мы далее сравнили промоторные активности этих 68 фрагментов при 37 ° C и 37 ° C с истощением Ca ²⁺. Как показано на фиг. 1C , активность 9 промоторов индуцировалась более чем в 2 раза, когда истощался Ca ²⁺. В отличие от изменений температуры, эта активация зависит от факторов, кодируемых плазмидой pYV, поскольку все эти активации были сильно снижены в штамме ΔpYV ( рис.1С ). Чтобы дополнительно подтвердить результаты слияния lacZ , мы применили qRT-PCR для проверки уровней мРНК генов lcrG и lcrQ в YPIII в различных условиях. В соответствии с анализом активности β-галактозидазы, уровень мРНК гена lcrG был сильно индуцирован при 37 ° C с истощением Ca ²⁺, а ген lcrQ индуцировался при 37 ° C ( Рис. S1 ).

Сравнивая Рис. 1B и Рис. 1C , мы заключаем, что большинство промоторов, активированных при температуре 37 ° C и условиях истощения Ca ²⁺, не перекрываются, что предполагает процесс активации Ysc-Yop T3SS, индуцированный 37 ° C. ° C и низкий Ca ²⁺ отличается.Как суммировано в таблице S2, гены, индуцированные при 37 ° C, могут быть разделены на четыре категории в соответствии с их функциями: I) репликация плазмиды pYV; II) компоненты аппарата секреции; III) эффекторные белки; и IV) гипотетические белки. Напротив, гены, индуцированные истощением Ca ²⁺, в основном кодируют эффекторы Ysc-Yop T3SS (, таблица S3, ). Основываясь на этих анализах, мы делаем вывод, что процесс индукции Ysc-Yop T3SS сначала включает гены, кодируемые из хромосомы YPIII, которые активируют транскрипцию большинства компонентов аппарата секреции, когда температура культивирования сдвигается с 26 ° C на 37 ° C, и полная активация требует других ключевых факторов, кодируемых плазмидой pYV, для максимальной экспрессии эффекторных белков.

Гены, индуцированные истощением Ca

²⁺, регулируются LcrF

Поскольку белок LcrF является единственным охарактеризованным регулятором транскрипции из плазмиды pYV, мы затем стремились изучить роль LcrF в экспрессии генов, индуцированной истощением Ca ²⁺. Для систематического анализа регуляторных мишеней LcrF мы сравнили промоторные активности плазмиды pYV в условиях, индуцируемых T3SS, в исходных штаммах YPIII и мутантном штамме lcrF (Δ lcrF ).Интересно, что активность этих девяти промоторов, индуцированных истощением Ca ²⁺, включая промоторы перед sycO (pYV0002), yadA (pYV0013), yopE (pYV0025), yopK (pYV0040) (pYV0058), yopN (pYV0065), yscN (pYV0067) и yopH (pYV0094) — все они резко снизились в Δ lcrF ( Fig 2A ), что предполагает, что все эти гены являются возможными целями. LcrF.Чтобы дополнительно подтвердить, что эти промоторы действительно регулируются LcrF, мы также сравнили активности промоторов в комплементарном штамме Δ lcrF . Как показано на фиг. 2B , экспрессия LcrF в Δ lcrF успешно восстанавливала активности этих промоторов.

Рисунок 2. Роль LcrF в контроле транскрипции генов T3SS.

(A) Относительная промоторная активность генов в мутанте lcrF (Δ lcrF ) по сравнению с родительским штаммом YPIII в условиях, индуцируемых T3SS.Промоутеры со сниженной активностью были отмечены красной точкой. (B) и (C) Влияние сверхэкспрессии LcrF (pOVR-LcrF) на промоторную активность его мишеней в штамме Δ lcrF при 37 ° C с или без Ca ²⁺. ** р <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.g002

На регуляцию транскрипции LcrF в T3SS не влияет Ca

²⁺
Поскольку транскрипция всех мишеней LcrF индуцируется истощением Ca ²⁺, мы затем сравнили регуляторные эффекты LcrF в условиях обогащения и истощения Ca ²⁺.Как показано на рис. , рис. 2C , сверхэкспрессия LcrF в Δ lcrF индуцировала экспрессию генов Yops в присутствии Ca ²⁺, что предполагает, что на регуляторную активность LcrF не влияет Ca ^2+.. Чтобы подтвердить это, мы затем проверили регуляторную роль LcrF по отношению к его мишеням в штамме ΔpYV. Наши результаты показали, что экспрессия LcrF также увеличивает активность этих промоторов как в богатых, так и в обедненных Ca ²⁺ условиях ( рис.S2 ). Эти данные не согласуются с результатами исследования Y. enterocolitica , в котором на роль LcrF не влияет Ca ²⁺ [31]. Однако наши данные продемонстрировали, что транскрипция всех промоторов, нацеленных на LcrF, сильно индуцируется истощением Ca ²⁺ при 37 ° C, что позволяет предположить, что другой кофактор (-ы) может ощущать изменение концентрации Ca ²⁺. и координировать с LcrF в регулировании Ysc-Yop T3SS.
Роль LcrQ в процессе регуляции LcrF
Белок LcrQ глобально регулирует Ysc-Yop T3SS в ответ на изменения концентрации Ca ²⁺, но механизм этой регуляторной роли не проиллюстрирован.Чтобы проверить, участвует ли LcrQ в контроле регуляторного эффекта LcrF, мы затем проверили мишени LcrQ, сравнив промоторные активности в родительских штаммах YPIII и сверхэкспрессируемых штаммах LcrQ, используя нашу библиотеку промоторов. Интересно, что все и только мишени LcrF показали пониженную промоторную активность в сверхэкспрессируемом штамме LcrQ по сравнению с таковыми в родительском штамме YPIII ( рис. 3А, ), что предполагает, что LcrQ разделяет те же мишени с LcrF в регуляции Ysc-Yop. T3SS.
Рисунок 3. Роль LcrQ в регуляции транскрипции генов T3SS.
(A) Сравнение относительной промоторной активности генов T3SS в условиях, индуцируемых T3SS, в сверхэкспрессируемом штамме LcrQ с YPIII, несущим плазмиду pOVR200. Промоторы, репрессированные LcrQ, были отмечены красной точкой. (B) Секреция (супернатант) и экспрессия (гранулы) эффекторов T3SS в штаммах LcrQ с избыточной экспрессией и Δ lcrF в условиях, индуцируемых T3SS. RpoA использовали в качестве контроля загрузки.(C) Секреция и экспрессия эффекторов T3SS в Δ lcrQ и LcrF сверхэкспрессируемых штаммах при 37 ° C с или без Ca ²⁺. (D) и (E) Влияние сверхэкспрессии LcrQ на промоторную активность трех мишеней LcrQ ( yopE , lcrG и yopH ) в штаммах YPIII ΔpYV и Δ lcrF .
https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.g003
Для дальнейшего анализа взаимосвязи между LcrF и LcrQ в регуляции T3SS Ysc-Yop мы затем сравнили фенотипы Δ lcrF с LcrQ сверх- экспрессированный штамм и сверхэкспрессированный штамм LcrF с Δ lcrQ .Экспрессия Yops в сверхэкспрессируемом штамме LcrQ была такой же, как и в Δ lcrF , которые оба были снижены в условиях, индуцируемых T3SS ( Рис. 3B, , дорожки 2 и 4), и секреция Yops также снижалась, что подтверждается данными Вестерн-блоттинг (, фиг. 3В, ). Сверхэкспрессия LcrF и делеция гена lcrQ активировали экспрессию и секрецию Yops в условиях, индуцируемых T3SS ( фиг. 3C, ). Более того, делеция гена lcrQ успешно секретировала белки LcrV и YopD в присутствии Ca ²⁺ при 37 ° C, как сообщалось другими [32], а сверхэкспрессия LcrF также способствовала секреции этих двух белков. ( Фиг.3С ). Вместе эти данные указывают на то, что LcrQ и LcrF тесно связаны во время регуляторного процесса.
Затем мы сравнили регуляторные эффекты LcrQ с его мишенями в родительских штаммах YPIII и ΔpYV. Как показано на фиг. 3D , промоторные активности мишеней LcrQ были на базовых уровнях в штамме ΔpYV, и сверхэкспрессия LcrQ не могла репрессировать эти промоторы в штамме ΔpYV; однако эти промоторные активности, очевидно, ингибировались сверхэкспрессией LcrQ в родительском штамме YPIII ( рис.S3 ), предполагая, что LcrQ репрессирует активность промотора, активированную белком, кодируемым pYV. Чтобы проверить, является ли этот фактор LcrF, мы проверили репрессивный эффект LcrQ в штамме Δ lcrF и не обнаружили репрессивной роли этих промоторов ( рис. 3E ). Стоит отметить, что активности этих промоторов в штамме LcrQ, сверхэкспрессируемом YPIII, были на тех же уровнях, что и в штамме Δ lcrF , что указывает на то, что LcrQ репрессирует только активированный LcrF, но не базальный уровень активности промотора.Вместе эти данные предполагают, что репрессивный эффект LcrQ требует LcrF.
Внутриклеточный LcrQ ингибирует регуляторную роль LcrF

Исходя из данных, полученных нами выше, мы предположили, что внутриклеточный LcrQ блокирует регуляторную роль LcrF. Если это так, уровни экспрессии этих двух белков важны для регуляторного процесса. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы сверхэкспрессировали LcrF с использованием плазмиды pOVR200 в штамме YPIII, несущем pKT-LcrQ, в котором белок LcrQ также был сверхэкспрессирован плазмидой pKT100.Как показано на фиг. 4A , сверхэкспрессия LcrF вызывала отрицательный регуляторный эффект LcrQ в этом штамме (по сравнению с дорожкой 4 с дорожкой 3). В соответствии с этим наблюдением, количество внутриклеточного LcrQ явно снижалось в штамме с избыточной экспрессией LcrF (, фиг. 4A, ). Следовательно, эти результаты можно объяснить балансом внутриклеточных количеств белков LcrF и LcrQ. Когда количество LcrF превышает LcrQ, LcrF доминирует над регуляторным эффектом. Чтобы доказать нашу гипотезу, мы затем заменили плазмиду, чтобы сверхэкспрессировать эти два белка.pOVR200, который содержит сильный промотор, использовали для сверхэкспрессии LcrQ, а pKT100 использовали для экспрессии LcrF. В этом случае количество внутриклеточного белка LcrQ было немного увеличено ( фиг. 4A, , по сравнению с дорожкой 7 с дорожкой 4), что, в свою очередь, сильно ингибировало положительный эффект LcrF ( рис. 4A, , по сравнению с дорожкой 7 с дорожкой 5). Все вместе эти результаты предполагают, что внутриклеточное количество LcrQ важно для блокирования регуляторной роли LcrF.

Рисунок 4.Влияние коэкспрессии LcrF и LcrQ на T3SS.

(A) Секреция и экспрессия Yops и LcrQ в штаммах со сверхэкспрессией LcrF или LcrQ или совместной экспрессией этих двух белков. (B) Эффекты совместной экспрессии GST-слитого LcrQ (G-Q) с LcrF на экспрессию и секрецию Yops и LcrQ. (C) Влияние сверхэкспрессии LcrF в мутанте yscV (Δ yscV _618–644) на экспрессию Yops. (D) Промоторная активность мишеней LcrF в штаммах Δ yscV _618–644, несущих pOVR-LcrF или pOVR200.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.g004

Для дальнейшего подтверждения нашей гипотезы мы использовали плазмиду pOVR200 для экспрессии GST-LcrQ (который, как известно, отменяет транспорт LcrQ [6], [33] ]) в штамме YPIII, несущем плазмиду pKT-LcrF. Как и ожидалось, GST-LcrQ не секретируется (, фиг. 4B, ). И сверхэкспрессия LcrF плазмидой pKT100 на этом фоне не показала очевидного эффекта на экспрессию или секрецию Yops (, фиг. 4B, , дорожка 7 сравнивается с дорожкой 5).В нашей предыдущей работе мы показали, что мутация гена yscV (Δ yscV _618–644), который кодирует компонент аппарата секреции, накапливает внутриклеточный белок LcrQ и, следовательно, подавляет экспрессию Yops [9]. . Затем мы сверхэкспрессировали белок LcrF на этом фоне и обнаружили, что как экспрессия Yops, так и промоторная активность его мишеней были активированы по сравнению с Δ yscV _618–644, несущим контрольную плазмиду pOVR200 ( рис.4C и D ). Взятые вместе, наши данные предполагают, что количество внутриклеточных LcrQ и LcrF жизненно важно для регуляции Ysc-Yop T3SS. Мы предполагаем, что внутриклеточный LcrQ устраняет роль LcrF при 37 ° C в условиях, богатых Ca ²⁺, и это ингибирование высвобождается, когда LcrQ секретируется вне клеток в условиях истощения Ca ²⁺.

LcrQ не взаимодействует напрямую с LcrF

Механизм регуляции белка LcrQ до конца не изучен.В этом белке не может быть обнаружен ДНК-связывающий домен [25], что позволяет предположить, что LcrQ не взаимодействует напрямую со своей целевой ДНК. Чтобы изучить, как LcrQ функционирует в регуляторном процессе LcrF, мы применили систему двух гибридных бактериальных аденилатциклаз (BACTH) для обнаружения возможного взаимодействия между этими двумя белками. Как показано на рис. 5 , LcrF может образовывать димер, как описано для белков семейства AraC [16], а LcrQ может взаимодействовать со своим шаперонным белком SycH [6], [7], что предполагает экспрессию этих двух белков в система BACTH стабильна.Однако мы не смогли обнаружить прямого взаимодействия между LcrF и LcrQ ( Fig. 5, ), предполагая, что др. Фактор (ы) также необходим для LcrQ, чтобы взаимодействовать с LcrF, чтобы блокировать его регуляторную роль.

Рисунок 5. Взаимодействие между LcrQ и LcrF с помощью бактериального двугибридного анализа.

Модель для двухгибридного анализа бактериальной аденилатциклазы показана на верхней панели. Взаимодействие между LcrQ и LcrF, обнаруженное бактериальной двугибридной системой, показано на нижней панели. ** p <0.01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.g005

Обсуждение

Ysc-Yop T3SS — это строго регулируемая система, и было продемонстрировано, что несколько модулей играют важную роль в этом регулирующем процессе [34]. Однако эта регуляция на уровне транскрипции систематически не анализировалась. В этом исследовании мы клонировали 97 некодирующих фрагментов плазмиды pYV в гибридную плазмиду lacZ и сравнили промоторные активности всех этих фрагментов в индуцируемых и не индуцируемых T3SS условиях.Ysc-Yop T3SS индуцируется низким сигналом Ca ²⁺ при 37 ° C in vitro [4]. В соответствии с этим фенотипом транскрипция генов плазмиды pYV также регулируется низким сигналом Ca ²⁺ при 37 ° C. На основании анализа промоторной активности мы предложили модель регуляции транскрипции Ysc-Yop T3SS в Yersinia . Как показано на рис. , рис. 6, , , факторы , закодированные на хромосоме, сначала определяют изменения температуры. При 37 ° C эти факторы активируют транскрипцию большинства генов плазмиды pYV, включая компоненты аппарата секреции и два регулятора LcrF и LcrQ.В этом случае LcrQ блокирует роль LcrF. Следовательно, экспрессия генов T3SS не может быть массово активирована LcrF при 37 ° C, когда LcrQ и LcrF оба локализуются внутри клетки. Однако низкий сигнал Ca ²⁺ будет запускать секрецию LcrQ, которая впоследствии высвобождает репрессивный эффект LcrQ, таким образом, будет проявляться положительная регуляторная роль LcrF.

LcrF и LcrQ — два охарактеризованных регулятора для Ysc-Yop T3SS в Yersinia . LcrF — классический регулятор транскрипции, который может напрямую связываться с несколькими промоторами плазмиды pYV [20].В этом исследовании мы систематически охарактеризовали мишени LcrF и идентифицировали 9 мишеней в YPIII. В соответствии с другими отчетами в Y. enterocolitica [20], yopE , yopH, yopQ / yopK, yadA, lcrGVHyopBD оперон и virC активируются LcrF. VirF не важен для транскрипции оперонов virA и virB в Y. enterocolitica [15], но оба эти оперона регулируются LcrF у Y.псевдотуберкулез. Связывание LcrF с этими двумя фрагментами промотора было подтверждено с помощью анализа задержки геля in vitro ( рис. S4 ), который предполагает, что эти два оперона также являются прямыми мишенями для LcrF. На регуляцию LcrF его мишеней не влияет Ca ²⁺, но транскрипция всех этих генов в YPIII индуцируется низким сигналом Ca ²⁺. Эти данные предполагают, что некоторые другие факторы также участвуют в активации роли LcrF в условиях низкого содержания Ca ²⁺.Роль LcrQ в регуляции T3SS не подтверждена документально. Было высказано предположение, что LcrQ образует комплекс с белками YopD-LcrH [35]. Недавнее исследование показало, что YscM1 (гомолог LcrQ в Y. enterocolitica ) связывается с рибосомами вместе с YopD-LcrH и впоследствии ингибирует трансляцию генов yop [36]. Наше текущее исследование предлагает другой механизм регуляторной роли LcrQ в блокировании роли LcrF. Этот процесс блокирования не является прямым, поскольку мы не наблюдали никакого прямого взаимодействия между этими двумя белками с помощью индивидуализированного бактериального двухгибридного анализа, что согласуется с предыдущим исследованием, показывающим, что LcrQ не действует как белок против LcrF. [25].Мы предполагаем, что другие не охарактеризованные белки могут действовать как линкер между этими двумя белками в этом процессе ( рис. 6, ). Функциональные гомологи LcrF и LcrQ обнаружены у других патогенов. Например, T3SS в Pseudomonas aeruginosa запускается низким содержанием Ca ²⁺ при 37 ° C, а также глобально регулируется двумя белками с противоположными эффектами: положительным регулятором семейства AraC ExsA и секретируемым негативным регулятором ExsE [37]. . Подобно LcrQ и LcrF, ExsE блокирует роль ExsA за счет непрямых взаимодействий с двумя промежуточными белками ExsC и ExsD [37].Необходимы дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать функциональные гомологи ExsC и ExsD в Yersinia и найти связывающие белки LcrF и LcrQ, которые предоставят информацию для детализации механизма регуляции транскрипции Ysc-Yop T3SS.

В дополнение к регуляторам, кодируемым плазмидой pYV, несколько белков, кодируемых хромосомами, также участвуют в регуляции Ysc-Yop T3SS. Например, YmoA, гистоноподобный белок, кодируемый хромосомами, напрямую связывается с промоторной областью гена lcrF , подавляя его транскрипцию.АТФ-зависимые протеазы ClpXP и Lon разлагают YmoA, когда температура окружающей среды достигает 37 ° C, что, в свою очередь, высвобождает транскрипцию гена lcrF и впоследствии активирует T3SS в Yersinia [38]. А регуляторный белок семейства LysR YtxR конкурирует с LcrF в связывании с промоторными областями генов yopE и yopH при регуляции T3SS [39], [40]. Все эти факторы регулируют Ysc-Yop T3SS косвенно через белок LcrF.В нашем исследовании мы обнаружили, что транскрипция большинства генов pYV активируется факторами, кодируемыми хромосомами, при 37 ° C, и не все эти гены, кодируемые pYV, относятся к мишеням LcrF. Эти данные предполагают, что фактор, кодируемый хромосомами, не является одним из вышеуказанных белков. Предыдущие исследования показали, что суперспирализация плазмиды pYV изменяется при 30 ° C и 37 ° C, и предположили, что это изменение топологии ДНК может быть температурным механизмом для экспрессии гена T3SS [41], [42]. Вопрос о том, являются ли не охарактеризованные факторы белками, участвующими в изменениях архитектуры ДНК, требует дальнейших исследований.

Как указано во введении, Ysc-Yop T3SS регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. В этом исследовании предложенная нами модель предназначена только для регуляции транскрипции Ysc-Yop T3SS, которая не может объяснить все фенотипы, которые мы наблюдали в нашем исследовании. Например, как предполагается в нашей модели, делеция гена lcrQ может облегчить роль LcrF в активации Yops при 37 ° C в присутствии Ca ²⁺, о чем свидетельствует тот факт, что блокирование роли LcrF под действием LcrQ уменьшается в штамме Δ lcrQ .Однако, как показано на фиг. , фиг. 3C , паттерн секреции штамма Δ lcrQ в условиях, богатых Ca ²⁺, отличается от нормального паттерна секреции, что предполагает, что некоторые другие факторы также могут участвовать в контроле пути секреции. Ysc-Yop T3SS. Кроме того, промоторная активность yopE и yopH остается высокой на фоне Δ lcrF ( фиг. 3E ), но результаты вестерн-блоттинга показали, что экспрессия этих белков не обнаруживается в этом штамме ( фиг.3B ), что указывает на то, что регуляция также происходит на посттранскрипционном уровне. Более того, мы обнаружили, что тепловая индукция yopE p- lacZ не зависит от плазмиды pYV, что отличается от результатов слияния yopE-lacZ ( yopE покрывает промотор и ∼ Кодирующая область 700 п.н. в этом слиянии) [19]. Это предполагает, что некоторые элементы, кодируемые pYV, могут ингибировать экспрессию yopE на посттранскрипционном уровне, например.g., белок YopD [21]. Экспрессия белка LcrQ была увеличена в штамме с избыточной экспрессией LcrF ( фиг. 4, и фиг. S5 ), но его промоторная активность не была активирована белком LcrF. Транскрипция — это только первый шаг к экспрессии гена. Регулирование на других уровнях следует рассматривать вместе, чтобы полностью прояснить сложный процесс регулирования Ysc-Yop T3SS.

Среди 97 клонированных некодирующих фрагментов 68 обладают промоторной активностью (суммировано в рис.S6 ), и несколько из этих некодирующих фрагментов, расположенных внутри оперона, например, некодирующий фрагмент выше гена yopD (pYV0054), который расположен в опероне lcrGVH-yopBD , были обнаружены с помощью промотора. активности, предполагая, что регуляция транскрипции PYV-кодируемого T3SS сложна. С другой стороны, мы не наблюдали промоторной активности некоторых генов, расположенных в качестве первого гена в опероне. Это может быть связано с тем, что некоторые выбранные нами фрагменты не покрывают полные промоторные области, поскольку аннотация открытой рамки считывания основана только на биоинформатическом анализе из NCBI, что может привести к неправильной аннотации.Тем не менее, банк промоторов, который мы создали в этом исследовании, будет способствовать дальнейшему анализу регуляции транскрипции у Yersinia , и результаты, полученные в этом исследовании, предоставят информацию для дальнейшего анализа регуляции транскрипции, относящегося к Ysc-Yop T3SS.

Дополнительная информация

Рисунок S6.

Расположение промоторов на плазмиде pYV. Некодирующие фрагменты с промоторной активностью, обнаруженные в этом исследовании, были помечены черным «P», а те, которые расположены выше первого гена в опероне, но не показали промоторной активности в нашем тесте, были помечены серым «P».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.00.s006

(TIF)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: YH SC. Проведены эксперименты: LL HY. Проанализированы данные: LL YH SC. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HY LF YL PL. Написал статью: YH SC.

Ссылки

1. Корнелис Г. Р., Боланд А., Бойд А. П., Гейджен С., Ириарте М. и др. (1998) Плазмида вирулентности Yersinia , геном против хозяина.Microbiol Mol Biol Rev 62: 1315–1352.
2. Navarro L, Alto NM, Dixon JE (2005) Функции эффекторных белков Yersinia в ингибировании иммунных ответов хозяина. Curr Opin Microbiol 8: 21–27.
3. Viboud GI, Bliska JB (2005) Внешние белки иерсинии: роль в модуляции сигнальных ответов и патогенезе клеток-хозяев. Анну Рев Микробиол 59: 69–89.
4. Yother J, Chamness TW, Goguen JD (1986) Регулируемый температурой плазмидный регулон, связанный с низким кальциевым ответом у Yersinia pestis .J Bacteriol 165: 443–447.
5. Juris SJ, Shao F, Dixon JE (2002) Эффекторы Yersinia нацелены на сигнальные пути млекопитающих. Cell Microbiol 4: 201–211.
6. Cambronne ED, Cheng LW, Schneewind O (2000) LcrQ / YscM1, регуляторы вирулона Yersinia yop , вводятся в клетки-хозяева по шаперон-зависимому механизму. Mol Microbiol 37: 263–273.
7. Wulff-Strobel CR, Williams AW, Straley SC (2002) LcrQ и SycH вместе функционируют в системе секреции Ysc типа III в Yersinia pestis , чтобы установить иерархию секреции.Mol Microbiol 43: 411–423.
8. Cambronne ED, Sorg JA, Schneewind O (2004) Связывание шаперона SycH с YscM1 и YscM2 активирует экспрессию эффектора yop в Yersinia enterocolitica . J Bacteriol 186: 829–841.
9. Ли Й, Ли Л., Хуанг Л., Фрэнсис М.С., Ху Й. и др. (2014) Yersinia Ингибирование с обратной связью секреции Ysc-Yop типа III снимается посредством YscV-зависимого распознавания и секреции LcrQ. Мол микробиол 91: 494–507.
10. Nilles ML, Williams AW, Skrzypek E, Straley SC (1997) Yersinia pestis LcrV образует стабильный комплекс с LcrG и может иметь связанную с секрецией регуляторную роль в ответе с низким содержанием Ca2 +. J Bacteriol 179: 1307–1316.
11. Cheng LW, Schneewind O (2000) Yersinia enterocolitica TyeA, внутриклеточный регулятор механизма типа III, необходим для специфического нацеливания YopE, YopH, YopM и YopN в цитозоль эукариотических клеток.J Bacteriol 182: 3183–3190.
12. Day JB, Ferracci F, Plano GV (2003). Транслокация YopE и YopN в эукариотические клетки с помощью делеционных мутантов Yersinia pestis yopN, tyeA, sycN, yscB и lcrG , измеренная с использованием фосфорилируемой пептидной метки и фосфоспецифических антител. Мол микробиол 47: 807–823.
13. Joseph SS, Plano GV (2007) Идентификация остатков TyeA, необходимых для взаимодействия с YopN и регулирования секреции Yop. Adv Exp Med Biol 603: 235–245.
14. Коста Т.Р., Эдквист П.Дж., Бромс Дж.Э., Ахлунд М.К., Форсберг А. и др. (2010) Самосборка YopD и связывание с LcrV способствуют секреционной активности типа III с помощью Yersinia pseudotuberculosis . J Biol Chem 285: 25269–25284.
15. Lambert de Rouvroit C, Sluiters C, Cornelis GR (1992) Роль активатора транскрипции, VirF, и температуры в экспрессии генов плазмиды pYV Yersinia enterocolitica . Mol Microbiol 6: 395–409.
16. Schleif R (2010) Белок AraC, регуляция оперона l-арабинозы в Escherichia coli и механизм переключения света действия AraC. FEMS Microbiol Rev 34: 779–796.
17. Скурник М., Тойванен П. (1992) LcrF является терморегулирующим активатором гена yadA генов Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis . J Bacteriol 174: 2047–2051.
18. China B, Michiels T, Cornelis GR (1990) Плазмида pYV Yersinia кодирует липопротеин YlpA, связанный с TraT.Mol Microbiol 4: 1585–1593.
19. Hoe NP, Minion FC, Goguen JD (1992) Измерение температуры в Yersinia pestis : регуляция транскрипции yopE с помощью LcrF. J Bacteriol 174: 4275–4286.
20. Wattiau P, Cornelis GR (1994) Идентификация последовательностей ДНК, распознаваемых VirF, активатором транскрипции регулона Yersinia yop. J Bacteriol 176: 3878–3884.
21. Chen Y, Anderson DM (2011) Иерархия экспрессии в системе секреции Yersinia типа III, установленная посредством распознавания РНК YopD.Мол микробиол 80: 966–980.
22. Schiano CA, Lathem WW (2012) Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов у видов Yersinia . Front Cell Infect Microbiol 2: 129
23. Bohme K, Steinmann R, Kortmann J, Seekircher S, Heroven AK и др. (2012) Согласованные действия термолабильного регулятора и уникального межгенного РНК-термодатчика контролируют вирулентность Yersinia . PLoS Pathog 8: e1002518.
24. Амер А.А., Коста Т.Р., Фараг С.И., Авикан Ю., Форсберг А. и др.(2013) Генно-инженерные химеры YopN-TyeA со сдвигом рамки считывания влияют на функцию системы секреции типа III у Yersinia pseudotuberculosis . PLoS One 8: e77767.
25. Stainier I, Iriarte M, Cornelis GR (1997) YscM1 и YscM2, два белка Yersinia enterocolitica , вызывающие подавление транскрипции yop . Mol Microbiol 26: 833–843.
26. Ху И, Лу П, Ван И, Динг Л., Аткинсон С. и др. (2009) OmpR положительно регулирует экспрессию уреазы, повышая кислотную выживаемость Yersinia pseudotuberculosis .Микробиология 155: 2522–2531.
27. OToole R, Milton DL, WolfWatz H (1996) Хемотаксическая подвижность необходима для вторжения в хозяина патогена рыб Vibrio anguillarum . Мол микробиол 19: 625–637.
28. Straley SC, Bowmer WS (1986) Гены вирулентности, регулируемые на уровне транскрипции Ca2 + в Yersinia pestis , включают структурные гены белков внешней мембраны. Инфекция иммунной 51: 445–454.
29. Balada-Llasat JM, Mecsas J (2006) Yersinia имеет тропизм к B- и T-клеточным зонам лимфатических узлов, который не зависит от системы секреции типа III.PLoS Pathog 2: e86.
30. Каримова G, Pidoux J, Ullmann A, Ladant D (1998) Бактериальная двугибридная система, основанная на восстановленном пути передачи сигнала. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 5752–5756.
31. Cornelis G, Sluiters C, de Rouvroit CL, Michiels T (1989) Гомология между virF , активатором транскрипции регулона вирулентности Yersinia , и AraC, регулятором оперона арабинозы Escherichia coli . J Bacteriol 171: 254–262.
32. Rimpilainen M, Forsberg A, Wolf-Watz H (1992) Новый белок, LcrQ, участвующий в низкокальциевой реакции Yersinia pseudotuberculosis , демонстрирует обширную гомологию с YopH. J Bacteriol 174: 3355–3363.
33. Lee VT, Anderson DM, Schneewind O (1998) Нацеливание белков Yersinia Yop в цитозоль клеток HeLa: одностадийная транслокация YopE через бактериальные и эукариотические мембраны зависит от шаперона SycE. Mol Microbiol 28: 593–601.
34. Dewoody RS, Merritt PM, Marketon MM (2013) Регулирование системы секреции Yersinia типа III: управление движением. Front Cell Infect Microbiol 3: 4.
35. Cambronne ED, Schneewind O (2002) Yersinia enterocolitica , секреция типа III: yscM1 и yscM2 регулируют экспрессию гена yop посттранскрипционным механизмом, который нацелен на 5′-нетранслируемую область yop mRNA.J Bacteriol 184: 5880–5893.
36. Kopaskie KS, Ligtenberg KG, Schneewind O (2013) Регулирование трансляции мРНК Yersinia enterocolitica , кодирующей субстрат секреции типа III. J Biol Chem 288: 35478–35488.
37. Urbanowski ML, Lykken GL, Yahr TL (2005) Секретируемый регуляторный белок связывает транскрипцию с секреторной активностью системы секреции Pseudomonas aeruginosa типа III. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 9930–9935.
38.Jackson MW, Silva-Herzog E, Plano GV (2004) АТФ-зависимые протеазы ClpXP и Lon регулируют экспрессию системы секреции Yersinia pestis типа III посредством регулируемого протеолиза YmoA, небольшого гистоноподобного белка. Mol Microbiol 54: 1364–1378.
39. Axler-Diperte GL, Miller VL, Darwin AJ (2006) YtxR, консервативный LysR-подобный регулятор, который индуцирует экспрессию генов, кодирующих предполагаемый гомолог токсина ADP-рибозилтрансферазы в Yersinia enterocolitica .J Bacteriol 188: 8033–8043.
40. Axler-DiPerte GL, Hinchliffe SJ, Wren BW, Darwin AJ (2009) YtxR действует как главный выключатель транскрипции для системы секреции Yersinia enterocolitica Ysc-Yop типа 3. J Bacteriol 191: 514–524.
41. Rohde JR, Fox JM, Minnich SA (1994) Терморегуляция в Yersinia enterocolitica совпадает с изменениями в суперспирализации ДНК. Mol Microbiol 12: 187–199.
42. Rohde JR, Luan XS, Rohde H, Fox JM, Minnich SA (1999) Плазмида вирулентности Yersinia enterocolitica pYV содержит множество внутренних изгибов ДНК, плавящихся при 37 ° C.. J Bacteriol 181: 4198–4204.

Количественное определение фармацевтических пептидов в плазме человека с помощью определения серы ЖХ-ИСП-МС

Метод количественного определения фармацевтического пептида в плазме человека был разработан с использованием градиентного элюирования LC-ICP-MS. Систему мембранной десольватации (MD) применяли для удаления органических растворителей из элюента перед обнаружением как SO ⁺ в ячейке динамической реакции (DRC) прибора ICP-DRC-MS и последующего количественного определения с помощью постколонки. изотопное разбавление (IDA).Перед анализом белки плазмы осаждали. Аналитические показатели качества, включая линейность, прецизионность, LOD, LOQ и точность, были признаны удовлетворительными для анализа образцов плазмы. Селективность разработанного метода продемонстрирована для пяти фармацевтически значимых пептидов: десмопрессина, пенетратина, субстанции Р, ПТГ (1-34) и инсулина. Для сравнения чувствительности также были проведены предварительные эксперименты на системе ICP-MS / MS с использованием кислорода для уменьшения воздействия органических растворителей.Результаты исследования продемонстрировали, что IDA после колонки LC-ICP-MS может представлять собой ценный дополнительный инструмент для количественной оценки немеченых пептидов на ранних этапах разработки лекарств, предлагая абсолютную количественную оценку без необходимости в стандартах для конкретных видов.

Эта статья в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Сканирование ассоциаций локусов количественных признаков ранней неспособности к чтению и способности с использованием объединенной ДНК и микрочипов 100K SNP в выборке из 5760 детей

Shaywitz SE.Дислексия. New Engl J Med 1998; 338 : 307–312.

CAS Статья Google ученый

Snowling M. Дислексия , 2-е изд. Блэквелл: Оксфорд, 2000.

Google ученый

Якобсон С. Насколько стойкими являются нарушения чтения? Индивидуальные кривые роста при чтении. Дислексия 1999; 5 : 78–93.

Артикул Google ученый

Shaywitz SE, Fletcher JM, Holahan JM, Shneider AE, Marchione KE, Stuebing KK et al .Устойчивость дислексии: продольное исследование Коннектикута в подростковом возрасте. Педиатрия 1999; 104 : 1351–1359.

CAS Статья Google ученый

DeFries JC, Knopik VS, Wadsworth SJ. Колорадо-близнецы Исследование неспособности читать. В: Дуэйн Д.Д. (ред.). Расстройства чтения и внимания: нейробиологические корреляты . Йорк Пресс: Балтимор, Мэриленд, 1999, стр. 17–41.

Google ученый

Харлаар Н, Спинат FM, Дейл ПС, Пломин Р.Генетические влияния на способности распознавания слов в раннем возрасте и инвалидность: исследование 7-летних близнецов. J Child Psychol Psychiatry 2005; 46 : 373–384.

Артикул Google ученый

Пломин Р., Ковас Ю. Универсальные гены и неспособность к обучению. Psychol Bull 2005; 131 : 592–617.

Артикул Google ученый

Пломин Р., Оуэн М.Дж., Макгаффин П.Генетическая основа сложного поведения человека. Science 1994; 264 : 1733–1739.

CAS Статья Google ученый

Paracchini S, Scerri T, Monaco AP. Генетический лексикон дислексии. Annu Rev Genomics Hum Genet 2007 [Электронный паб перед печатью].

Fisher SE, Francks C. Гены, познание и дислексия: учимся читать геном. Trends Cogn Sci 2006; 10 : 250–257.

Артикул Google ученый

Уильямс Дж., О’Донован М.С. Генетика дислексии развития. евро J Hum Genet 2006; 14 : 681–689.

CAS Статья Google ученый

МакГрат Л.М., Смит С.Д., Пеннингтон Б.Ф. Прорыв в поисках генов-кандидатов на дислексию. Trends Mol Med 2006; 12 : 333–341.

CAS Статья Google ученый

Schumacher J, Hoffmann P, Schmael C, Schulte-Korne G, Nothen MM. Генетика дислексии: меняющийся ландшафт. J Med Genet 2007; 44 : 289–297.

CAS Статья Google ученый

Деффенбахер К.Е., Кеньон Дж. Б., Гувер Д.М., Олсон Р.К., Пеннингтон Б.Ф., ДеФрис Дж. С. и др. .Уточнение локуса количественного признака 6p21.3, влияющего на дислексию: анализ сцепления и ассоциации. Hum Genet 2004; 115 : 128–138.

CAS Статья Google ученый

Риш, штат Нью-Джерси. В поисках генетических детерминант в новом тысячелетии. Nature 2000; 405 : 847–856.

CAS Статья Google ученый

Sham PC, Cherny SS, Purcell S, Hewitt JK.Сила взаимосвязи по сравнению с анализом ассоциаций количественных признаков с использованием моделей дисперсионных компонентов для данных о родстве. Am J Hum Genet 2000; 66 : 1616–1630.

CAS Статья Google ученый

Zondervan KT, Cardon LR. Сложное взаимодействие между факторами, влияющими на аллельную ассоциацию. Nat Rev Genet 2004; 5 : 89–100.

CAS Статья Google ученый

Кардон Л. Р., Белл Дж.Ассоциация дизайна исследования сложных заболеваний. Nat Rev Genet 2001; 2 : 91–99.

CAS Статья Google ученый

Иоаннидис Дж. П., Трикалинос Т.А., Хури М.Дж. Влияние малых размеров эффекта отдельных генетических вариантов на дизайн и интерпретацию исследований генетических ассоциаций сложных заболеваний. Am J Epidemiol 2006; 164 : 609–614.

Артикул Google ученый

Syvanen AC.К полногеномному генотипированию SNP. Nat Genet 2005; 37 (Дополнение): S5 – S10.

Артикул Google ученый

Hirschhorn JN, Daly MJ. Полногеномные ассоциативные исследования распространенных заболеваний и сложных признаков. Nat Rev Genet 2005; 6 : 95–108.

CAS Статья Google ученый

Carlson CS, Eberle MA, Kruglyak L, Nickerson DA.Картирование сложных локусов болезни в исследованиях полногеномных ассоциаций. Nature 2004; 429 : 446–452.

CAS Статья Google ученый

Newton-Cheh C, Hirschhorn JN. Исследования генетических ассоциаций сложных признаков: вопросы проектирования и анализа. Mutat Res 2005; 573 : 54–69.

CAS Статья Google ученый

Thomas DC, Haile RW, Duggan D.Последние разработки в области сканирования ассоциаций генома: итоги семинара и обзор. Am J Hum Genet 2005; 77 : 337–345.

CAS Статья Google ученый

Ван, Вайоминг, Барратт Б.Дж., Клейтон Д.Г., Тодд Дж.А. Полногеномные ассоциации исследований: теоретические и практические вопросы. Nat Rev Genet 2005; 6 : 109–118.

CAS Статья Google ученый

Knight J, Sham P.Дизайн и анализ ассоциативных исследований с использованием объединенной ДНК из больших образцов близнецов. Behav Genet 2006; 36 : 665–677.

Артикул Google ученый

Дарваси А, Соллер М. Селективное объединение ДНК для определения связи между молекулярным маркером и локусом количественного признака. Genetics 1994; 138 : 1365–1373.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Нортон Н., Уильямс Н.М., О’Донован М.С., Оуэн М.Дж.Объединение ДНК как инструмент крупномасштабных ассоциативных исследований сложных признаков. Ann Med 2004; 36 : 146–152.

CAS Статья Google ученый

Мясник Л.М., Миберн Э., Лю Л., Фернандес С., Хилл Л., Аль Чалаби А и др. . Генотипирование объединенной ДНК на микрочипах: систематический скрининг генома тысяч SNP в больших выборках для обнаружения QTL для сложных признаков. Behav Genet 2004; 34 : 549–555.

Артикул Google ученый

Meaburn E, Butcher LM, Liu L, Fernandes C, Hansen V, Al Chalabi A и др. . Генотипирование пулов ДНК на микрочипах: решение проблемы QTL больших выборок и большого количества SNP. BMC Genomics 2005; 6 : 52.

Артикул Google ученый

Meaburn E, Butcher LM, Schalkwyk LC, Plomin R.Генотипирование объединенной ДНК с использованием микрочипов 100K SNP: шаг к сканированию ассоциаций в масштабе всего генома. Nucleic Acids Res 2006; 34 : e27.

Артикул Google ученый

Pearson JV, Huentelman MJ, Halperin RF, Tembe WD, Melquist S, Homer N et al . Выявление генетической основы сложных расстройств с помощью исследований ассоциации однонуклеотидного полиморфизма на основе объединения геномов. Am J Hum Genet 2007; 80 : 126–139.

CAS Статья Google ученый

Киров Г., Николов И., Георгиева Л., Москвина В., Оуэн М.Дж., О’Донован М.С. Объединенное ДНК-генотипирование на массивах генотипирования Affymetrix SNP. BMC Genomics 2006; 7 : 27.

Артикул Google ученый

Мясник Л.М., Миберн Э., Найт Дж., Фальшивый П.С., Шалквик Л.С., Крейг И.В. и др. .SNP, микрочипы и объединенная ДНК: идентификация четырех локусов, связанных с легкими умственными нарушениями, в выборке из 6000 детей. Hum Mol Genet 2005; 14 : 1315–1325.

CAS Статья Google ученый

Эванс Д.М., Кардон Л.Р., Моррис А.П. Прогнозирование генотипа с использованием плотной карты SNP. Genet Epidemiol 2004; 27 : 375–384.

Артикул Google ученый

Ке Х, Хант С., Таппер В., Лоуренс Р., Ставридес Дж., Гори Дж. и др. .Влияние плотности SNP на мелкомасштабные модели неравновесия по сцеплению. Hum Mol Genet 2004; 13 : 577–588.

CAS Статья Google ученый

Оливер Б., Пломин Р. Исследование раннего развития близнецов (TEDS): многомерное продольное генетическое исследование языковых, когнитивных и поведенческих проблем с детства до подросткового возраста. Twin Res Hum Genet 2007; 10 : 96–105.

Артикул Google ученый

Шам П., Бейдер Дж. С., Крейг И., О’Донован М., Оуэн М. Объединение ДНК: инструмент для крупномасштабных ассоциативных исследований. Nat Rev Genet 2002; 3 : 862–871.

CAS Статья Google ученый

Torgesen JK, Wagner RK, Rashotte CA. Тест на эффективность чтения слов . Pro-Ed: Остин, Техас, 1999.

Google ученый

Управление квалификаций и учебных программ. Ключевой этап QCA 1: Организация оценки и отчетности. Управление квалификаций и учебных программ Великобритании 1999.

Дейл П.С., Харлаар Н., Пломин Р. Телефонное тестирование и оценка учителем навыков чтения у 7-летних: I. Существенное соответствие для выборки из 5808 детей И для крайностей. Чтение и письмо: междисциплинарный журнал 2005; 18 : 385–400.

Артикул Google ученый

Харлаар Н, Дейл ПС, Пломин Р. Соответствие телефонного тестирования и оценки учителем навыков чтения в выборке 7-летних близнецов: II. Сильное генетическое совпадение. Чтение и письмо: Междисциплинарный журнал 2005; 18 : 401–423.

Артикул Google ученый

Lyon JR, Fletcher JM, Shaywitz BA, Shaywitz SE, Torgesen JK, Wood FB et al .Переосмысление специального образования для нового века. В: Finn CE, Rotherham RAJ, Hokanson CR (ред.). Переосмысление неспособности к обучению, Томас Б. . Фонд Фордхэма и Институт прогрессивной политики: Вашингтон, округ Колумбия, 2001 г., стр. 259–287.

Google ученый

Фриман Б., Смит Н., Кертис С., Хакетт Л., Милл Дж., Крейг И. ДНК из буккальных мазков, полученных по почте: оценка влияния хранения на долгосрочную стабильность и пригодность для генотипирования с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции. Behav Genet 2003; 33 : 67–72.

CAS Статья Google ученый

Мацузаки Х., Донг С., Лой Х, Ди Х, Лю Дж., Хаббелл Е и др. . Генотипирование более 100 000 SNP на паре массивов олигонуклеотидов. Nat Methods 2004; 1 : 109–111.

CAS Статья Google ученый

Tobler AR, Short S, Andersen MR, Paner TM, Briggs JC, Lambert SM и др. .Система генотипирования SNPlex: гибкая и масштабируемая платформа для генотипирования SNP. J Biomol Tech 2005; 16 : 398–406.

PubMed PubMed Central Google ученый

Коэн Дж. Статистический анализ мощности для поведенческих наук . Academic Press: New York, 2004.

. Google ученый

Лау В., Куо Т.Ю., Таппер В., Кокс С., Коллинз А.Использование крупномасштабных вычислений для построения карт неравновесия сцепления с высоким разрешением генома человека. Bioinformatics 2007; 23 : 517–519.

CAS Статья Google ученый

Klein RJ, Zeiss C, Chew EY, Tsai JY, Sackler RS, Haynes C и др. . Полиморфизм фактора комплемента H при возрастной дегенерации желтого пятна. Science 2005; 308 : 385–389.

CAS Статья Google ученый

Duerr RH, Taylor KD, Brant SR, Rioux JD, Silverberg MS, Daly MJ et al .Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует IL23R как ген воспалительного заболевания кишечника. Science 2006; 314 : 1461–1463.

CAS Статья Google ученый

Пломин Р., ДеФрис Дж. К., Крейг И. В., МакГаффин П. Поведенческая генетика. В: Plomin R, DeFries JC, Craig IW, McGuffin P (ред.). Поведенческая генетика в постгеномную эпоху . Американская психологическая ассоциация: Вашингтон, округ Колумбия, 2003 г., стр. 3–15.

Глава Google ученый

Simpson CL, Knight J, Butcher LM, Hansen VK, Meaburn E, Schalkwyk LC и др. . Центральный ресурс для точной оценки частоты аллелей из объединенной ДНК, генотипированной на ДНК-микрочипах. Nucleic Acids Res 2005; 33 : e25.

Артикул Google ученый

Cargill M, Daley GQ. Майнинг для SNP: проверка общих вариантов — проверка гипотезы распространенного заболевания. Pharmacogenomics 2000; 1 : 27–37.

CAS Статья Google ученый

Craig DW, Huentelman MJ, Hu-Lince D, Zismann VL, Kruer MC, Lee AM и др. . Идентификация локусов, вызывающих заболевание, с использованием подхода генотипирования на основе массивов объединенной ДНК. BMC Genomics 2005; 6 : 138.

Артикул Google ученый

Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TD и др. .Глобальные вариации числа копий в геноме человека. Nature 2006; 444 : 444–454.

CAS Статья Google ученый

Wong KK, deLeeuw RJ, Dosanjh NS, Kimm LR, Cheng Z, Horsman DE и др. . Комплексный анализ общих вариаций числа копий в геноме человека. Am J Hum Genet 2007; 80 : 91–104.

CAS Статья Google ученый

Массачусетс 8-хклассники инициируют закон, чтобы очистить имя последней салемской «ведьмы» Kids News Статья

Художественная иллюстрация зала суда над Салемскими ведьмами (Источник: Public domain, / Wikimedia Commons)

Печально известные процессы над Салемскими ведьмами, которые произошедшие в колониальном Массачусетсе между 1692 и 1693 годами, были темным периодом в истории права Америки.Более 200 человек были неправомерно обвинены в колдовстве, 20 были казнены. За 328 лет, прошедших с тех пор, большинство обвиняемых были освобождены от каких-либо преступлений. Однако по неизвестным причинам Элизабет Джонсон-младшая, которой на тот момент было всего 22 года, так и не помиловали. Теперь, благодаря упорному труду восьмого класса средней школы North Andover, штат Массачусетс, ее имя, наконец, может быть очищено.

Что привело к суду над салемскими ведьмами?

В январе 1692 года у девятилетней дочери и 11-летней племянницы преподобного Сэмюэля Пэрриса — первого рукоположенного служителя деревни Салем (современный Данверс, Массачусетс) — начались «припадки».»Из-за болезни молодые девушки кричали, бросали предметы и издавали странные звуки. Вскоре после этого другой 11-летний подросток начал вести себя аналогичным образом. Не сумев определить причину, местный врач набожной и строго религиозной общины возложил вину за это на паранормальные явления. 29 февраля 1692 года три женщины — Титуба, рабыня Пэрриса на Карибах; Сара Гуд, бездомная нищая, и Сара Осборн, пожилая бедная женщина — были обвинены и осуждены за практику «колдовства».»

Дальше дела только ухудшались. Жители деревни Салем начали видеть» ведьм «повсюду и обвинять их в любых несчастьях или болезнях. В стремлении искоренить зло, которое могло скрываться среди них, соседи, друзья и даже семья Обвиняемые — в основном женщины в возрасте от 5 до почти 80 лет — часто подвергались пыткам с целью получения признательных показаний и признаны виновными без доказательств. Особенно пострадала семья Джонсон: около 28 человек, включая ее мать, были обвинены в колдовстве .

Джайлз Кори был убит тяжелыми камнями после того, как отказался признаться в том, что он ведьма во время (Фото: Тим Эвансон / CC0 / Flickr)

года. В 1957 году штат Массачусетс официально извинился за этот печальный эпизод в своей истории. Он помиловал многих из тех, чьи имена были записаны как ведьмы. В 2001 году по настоянию некоторых потомков в законодательство были внесены еще пять имен. В результате этого изменения были оправданы все салемские «ведьмы», кроме Джонсона.

«Мы не знаем почему, но во всех этих усилиях по помилованию женщин, осужденных за колдовство, но так и не казненных, Элизабет никогда не участвовала», — сказал Boston Times историк Салемского государственного университета Эмерсон Бейкер.«В глазах закона ее приговор формально остается в силе».

Как ученики средней школы North Andover помогли Джонсону?

Восьмиклассники Северного Андовера узнали о ситуации Джонсона в 2020 году на уроке гражданского права, который проводила Кэрри Лапьер. После осознания того, что у Джонсон, которая никогда не была замужем и не имела детей, нет потомков, которые помогли бы очистить ее имя, и 13-14-летние подростки решили посвятить необходимый «проект гражданских действий» ее делу. Они потратили большую часть учебного года на расследование этого дела, а затем привлекли сенатора штата Дайану ДиЗоглио к помощи в написании закона, который поможет очистить имя Джонсона.Студенты также написали отдельным законодателям, призывая их принять срочные меры, чтобы очистить имя Джонсона.

Двести человек были осуждены во время процесса над Салемскими ведьмами (Credit Public Domain / Wikimedia Commons)

Лапьер сообщил Radio Boston, « Эти ученики изучают гражданское право — 8-й класс в Массачусетсе теперь является классом гражданского права, и они ответственный за так называемый проект гражданских действий.